造血前駆細胞の神経幹細胞への直接リプログラミング

遺伝的に改変された造血前駆細胞の細胞懸濁液から始めます。

これらの細胞は、神経幹細胞への再プログラミングに必要な転写因子を発現します。このプロセスは、直接再プログラミングと呼ばれます。

細胞を神経前駆培地を含む細胞外マトリックスコーティングマルチウェルプレートに移し、インキュベートします。

細胞外マトリックスは、細胞の付着と増殖のための三次元足場を提供します。

インキュベーション中、造血前駆細胞によって発現される転写因子は、神経幹細胞への形質転換を可能にする一連の分子イベントを開始します。

神経前駆細胞培地には、誘導された神経幹細胞の生存に有利な因子が含まれています。

インキュベーション後、この培地を新鮮な神経前駆培地に置き換えて、細胞増殖を促進します。

セルスクレーパーを使用して細胞を切り離します。

この懸濁液を収集し、細胞を神経幹細胞培地を含むウェルに移します。

人工神経幹細胞の維持のためにインキュベートします。

細胞が30〜50%コンフルエントになったら、上清を吸引して予備し、次に1ミリリットルの神経前駆培地を各ウェルに加えます。上清の球体を使用してバックアッププレートを作成するには、予備の上清を170倍gで10分間遠心分離します。

次に、上清を吸引し、ペレットを神経前駆培地に再懸濁します。マトリゲルコーティングされた24ウェルプレートにプレートします。細胞が60%から80%のコンフルエンスに達するまで、通常は1週間後に、細胞の各プレートの培地を1日ごとに交換します。

細胞が必要なコンフルエンスに達したら、上清を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの神経幹細胞培地を加えます。次に、細胞スクレーパーを使用して細胞を解離し、その後非常に穏やかなピペッティングを行います。

次に、細胞を24ウェルプレートの1つのウェルから6ウェルプレートの1つのウェルに移します。ウェルにさらにミリリットルの培地を加え、すべてのウェルで手順を繰り返した後、6ウェルプレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。

細胞が60%のコンフルエンスに達するまで、培地の全容量を1日おきに交換します。毎回、先に示したように、細胞を解離させ、1対3の比率で再プレーティングします。