成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞コロニーの単離

ラミニンでコーティングされたマルチウェルプレートで、成人ヒト線維芽細胞に由来する誘導神経前駆細胞コロニーの接着培養から始めます。

コロニーをバッファーで洗浄して非接着細胞を除去し、次に新しいバッファーを追加します。

個々のコロニーの周りをこすり落として、周囲の細胞を除去します。

コロニーを神経誘導培地を含む新鮮なラミニンコーティングウェルに移します。

コロニーを機械的に分解して、単一細胞懸濁液を得る。

細胞外マトリックスタンパク質であるラミニンは、前駆細胞の表面タンパク質と相互作用し、ウェル表面への細胞接着を促進します。

細胞に侵入して特定のプロテインキナーゼをブロックし、細胞のアポトーシスを防ぐ低分子阻害剤を追加します。

神経誘導培地中に存在する成長因子および小分子は、前駆細胞の増殖を促進する。

定期的に

培地を交換して栄養素を補充し、継続的な前駆細胞の増殖を促進します。

コンフルエント培養、または完全に覆われた細胞層は、誘導された神経前駆細胞の増殖が成功したことを示します。

1日後、プレートからラミニンを吸引し、200マイクロリットルの神経誘導培地をウェルに加えます。6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルの神経誘導培地を加える前に、ピックするコロニーを含む6ウェルプレートをDPBSで1回

洗浄します。 細

い針を使用してコロニーの周りをこすり落とし、50マイクロリットルに設定された200マイクロリットルのピペットマンに取り付けられたピペットチップを使用してコロニーをピッキングすることにより、細胞を機械的にピッキングします。

各コロニーをラミニンでコーティングされた48ウェルプレートの1つのウェルに移し、上下に10回ピペッティングすることにより、機械的に単一細胞懸濁液を生成します。最終濃度10マイクロモルのRhoキナーゼ阻害剤を細胞に添加します。48ウェルプレート上で細胞を摂氏37度、5%CO₂で2日間増殖させます。細胞が80%から90%のコンフルエントに達するまで、2日ごとに培地を交換します。