ヒト神経芽腫細胞株の成熟ニューロンへの分化

高血清濃度培地中のニューロン様細胞および上皮様細胞を含む未分化神経芽細胞腫細胞株から始めます。

培地を取り除き、レチノイン酸を添加した血清濃度を低下させた分化培地を加えます。

血清欠乏は上皮様細胞の増殖を防ぎます。

レチノイン酸は、ニューロン様細胞のニューロン遺伝子発現を誘導し、より分化した表現型に変換します。

トリプシン-EDTAカクテルを加えて、部分分化した細胞を分離します。

トリプシンをブロックするために血清タンパク質を含む培地を追加します。

細胞をプレートし、レチノイン酸とさらに低下した血清レベルを含む新鮮な分化培地を導入します。

細胞は拡張されたプロセスを発達させ続けます。

トリプシンを加えて細胞を剥離します。

次に、トリプシンをブロックする培地を加え、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた皿に細胞をプレーティングして、細胞の接着を促進します。

最後に、神経成長因子を含む無血清培地を補給します。

これらの要因は、広範な分岐神経突起を示す成熟ニューロンへの終末分化を誘発します。

0日目に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、塩基性増殖培地を使用して細胞懸濁液を1ミリリットルあたり50,000細胞に希釈します。35ミリメートルのディッシュあたり2ミリリットルの細胞をプレートし、ディッシュあたり合計100,000個の細胞をプレートします。続いて、細胞を摂氏37度のインキュベーターに入れます。

初日に、加温して平衡化した培地にRAを加えます。古いメディアをそっと吸引して廃棄します。次に、RAを含む分化培地番号1を2ミリリットルの35ミリメートルの各ディッシュに加え、インキュベーターに戻します。

7日目に、古いメディアをそっと吸引して廃棄します。200マイクロリットルの温めたトリプシン-EDTAを各35ミリメートルの皿に加えます。次に、細胞をインキュベーターに2〜3分間、または顕微鏡で観察するようにプレートから目に見えて持ち上げられるまで入れます。

RAを含む分化培地番号12ミリリットルを各35ミリメートルの皿に添加してトリプシンをクエンチし、培地を使用してプレートの残りのニューロン細胞をすすぎます。次に、全容量を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。

10ミリリットルのプラスチックピペットで、5回以内にゆっくりと上下にやさしく粉砕します。その後、2ミリリットルの細胞懸濁液を新鮮な35ミリメートルの皿に分注してから、インキュベーターに戻します。

10日目に、メディアをそっと吸引して廃棄します。200マイクロリットルの温めたトリプシンを各35ミリメートルの皿に加え、顕微鏡で観察するように、室温で約1〜2分間、またはニューロンが皿から目に見えて持ち上げられるまでインキュベートします。

プロトコルの10日目は、分化のこの段階での細胞の感