マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

マウス胚性幹細胞(mESC)を分化培地に懸濁してインキュベートします。

懸

濁培養では、mESCは凝集して胚様体またはEBと呼ばれる構造を形成します。

EBは、発育中の胚を模倣した3次元凝集体であり、神経細胞に分化することができます。

EBをチューブに移し、重力によって沈降させます。

栄養枯渇した培地を取り除きます。EBを新鮮な培地に再懸濁し、培養皿に移します。

EBの増殖を促進するために懸濁培養をインキュベートします。

培地に懸濁したEBをマルチウェルプレートに移します。ウェルは接着タンパク質でコーティングされており、EBが付着することができます。

細胞に入り、転写複合体の形成を引き起こすレチノイン酸を導入します。

この複合体は遺伝子発現を誘導し、細胞の神経前駆細胞 (NPC) への分化を促進し、拡張された細胞プロセスを示します。

150万個のマウス胚性幹細胞を10ミリリットルの基礎分化培地中の非粘着性細菌皿に加え、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートして胚様体形成を可能にします。

2日後、細胞凝集体を15ミリリットルの遠心分離管に移し、重力によって沈降させます。上清を取り除き、10ミリリットルの新鮮な基礎分化培地を加えて、胚様体を再懸濁します。次に、それらを新しい非粘着皿に植え替え、さらに2日間インキュベートします。

約

50個の胚様体を1ウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に集めて、ゼラチンでコーティングされた6ウェルプレートに播種します。レチノイン酸誘導の場合は、各ウェルに2マイクロリットルのRHAストックを1マイクロモルの最終濃度まで添加します。プレートをインキュベーターに戻し、さらに4日間細胞を分化させます。