感覚神経節からの細胞の単離

事前に洗浄した感覚神経節をチューブに入れます。

消化酵素の混合物を含む解離溶液を加え、インキュベートします。

これらの酵素は細胞外マトリックスを分解し、個々の細胞を放出します。

インキュベーション後、解離液を取り除きます。

神経節をリン酸緩衝液で洗浄し、新鮮な解離溶液を加えます。

神経節を上下にピペットで動かして細胞を解離させます。

懸濁液をセルストレーナーに通して、塊を取り除きます。

スト

レーナーの底から残りの細胞を集め、チューブに入れます。

細胞懸濁液を密度勾配チューブと遠心分離機の上に層状にします。

形状と質量の違いに基づいて、細胞は下層に移動し、細胞破片は上層に残ります。

上層を廃棄します。

残りの細胞懸濁液に新鮮な培地を加え、遠心分離します。

上清を廃棄し、さらに使用するために感覚神経節細胞を保管します。

感覚神経節を採取した後、神経節を乱すことなく、各チューブから500マイクロリットルの神経節解離溶液を吸引します。次に、各サンプルに 1 ミリリットルの PBS を加え、神経節がチューブの底に落ち着くのを待ちます。

次に、PBSを除去し、消化酵素を添加した1ミリリットルの神経節解離液をニューロンに加えます。消化酵素の年齢に基づいて、チューブを摂氏37度で適切な時間インキュベートし、15分ごとにチューブを振って短時間フリックして、神経節が消化液で覆われていることを確認します。

神経細胞が消化されている間、サンプルごとに1.5ミリリットルのチューブ1本に、400マイクロリットルの28%密度の溶液に、400マイクロリットルの新しく調製された12%密度の溶液をゆっくりと慎重に加えます。2 つの異なるレイヤーが表示され、一方が他方よりも暗いはずです。

消化期間の終わりに、消化酵素を廃棄し、先ほど示したように1ミリリットルのPBSで神経節を2回洗浄します。2回目の洗浄後、200マイクロリットルの新鮮な神経節解離溶液を各チューブに加えます。

次に、100マイクロリットルの容量に設定された200マイクロリットルのピペットを使用して、気泡を避けるように注意しながら、神経節を上下に数回ピペットで移動させ、細胞を単一細胞懸濁液に解離させます。無傷の組織片が見えない場合は、70ミクロンの細胞ストレーナーを片手でしっかりと持ち、解離した細胞溶液をストレーナーの中央にピペットで入れます。次に、解離チューブを100マイクロリットルの新鮮な神経節解離溶液で洗浄し、追加の細胞を収集します。

洗浄液をストレーナーでろ過し、新しいピペットチップを使用してストレーナーの下側に残っている細胞含有溶液を吸引し、細胞懸濁液に加えます。次に、事前に準備した密度勾配の上に300マイクロリットルの細胞すべてを慎重に重ね、遠心分離によって神経節細胞を収集します。

遠心分離の最後に、細胞破片の大部分を含