げっ歯類の脳スライスの長期培養のための改質ローラーチューブ法

げっ歯類の脳から得られた脳スライスを取ります。スライスは、海馬ニューロンを含む海馬で構成されています。

脳スライスを鶏の血漿を含むカバーガラスに移します。

トロンビンと混合した血漿をスライスに塗布します。トロンビンは血漿凝固を誘導し、カバーガラスへのスライスの接着を促進する生物学的足場を作成します。

平らな面に穴があり、チューブの外側の穴の周りに粘着ディスクが取り付けられた平らなローラーチューブを取ります。

カバーガラスを粘着ディスクに配置し、脳のスライスがチューブの内部を向くようにします。

チューブにニューロン培養培地を加え、二酸化炭素と空気の混合物を流します。

チューブにキャップをかぶせ、ローラーラックに挿入し、ローリング運動でインキュベートします。

ローリングインキュベーションによって提供される通気と培地の栄養素は、脳スライスの長期培養をサポートします。

まず、ローラーチューブラックを準備し、付属のテキストプロトコルに記載されているように、ローラーチューブに穴を開けるのを補助する治具を作成します。治具を使用して、平らな面が上を向くように、平らな1センチメートルのプラスチック製培養チューブを所定の位置に保持します。次に、直径6ミリメートルの穴を開け、中心を底から1センチメートル、チューブの側面の間の中央にします。

回転バリ取りツールを使用して、穴の端を滑らかにし、穴の内側の端に4つの溝を作って、回転中の穴の排水を容易にします。次に、チューブを 70% エタノールですすぎ、生物学的安全キャビネットで自然乾燥させます。12 mm のパンチングされた粘着性シリコーンゴム ディスクでチューブを UV ランプの下で 40 分間滅菌します。

20分後、露出した表面がすべて滅菌されるようにチューブとディスクの位置を変更します。次に、粘着ディスクから白い裏地をはがします。穴を合わせ、シリコーンゴムをチューブの外側に貼り付けます。

スライスが得られたら、準備したカバーガラスのフォトエッチング面の中央に2マイクロリットルの鶏血漿を置きます。プラズマを少し広げて、直径3〜4ミリメートルのスポットを実現します。次に、滅菌された先端の狭いスパチュラを使用して、準備された脳スライスを持ち上げます。閉じた鉗子を使用して、スライスを持ち上げながらスライスをスパチュラの先端に保持します。へらをカバーガラスのプラズマスポットに接触させ、閉じた鉗子でスライスをカバーガラスに押し込みます。

スライスを置く前にカバーガラスにひよこ血漿の薄層を追加し、スライスを覆うために最小限のトロンビン処理血漿を追加します。スライスが浮いていると、血栓が取り除かれても付着したままになりません。

次に、2.5マイクロリットルの血漿と2.5マイクロリットルのトロンビンを別のチューブに混合します。この混合物2.5マイ