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げっ歯類の脳から得られた脳スライスを取ります。スライスは、海馬ニューロンを含む海馬で構成されています。
脳スライスを鶏の血漿を含むカバーガラスに移します。
トロンビンと混合した血漿をスライスに塗布します。トロンビンは血漿凝固を誘導し、カバーガラスへのスライスの接着を促進する生物学的足場を作成します。
平らな面に穴があり、チューブの外側の穴の周りに粘着ディスクが取り付けられた平らなローラーチューブを取ります。
カバーガラスを粘着ディスクに配置し、脳のスライスがチューブの内部を向くようにします。
チューブにニューロン培養培地を加え、二酸化炭素と空気の混合物を流します。
チューブにキャップをかぶせ、ローラーラックに挿入し、ローリング運動でインキュベートします。
ローリングインキュベーションによって提供される通気と培地の栄養素は、脳スライスの長期培養をサポートします。
まず、ローラーチューブラックを準備し、付属のテキストプロトコルに記載されているように、ローラーチューブに穴を開けるのを補助する治具を作成します。治具を使用して、平らな面が上を向くように、平らな1センチメートルのプラスチック製培養チューブを所定の位置に保持します。次に、直径6ミリメートルの穴を開け、中心を底から1センチメートル、チューブの側面の間の中央にします。
回転バリ取りツールを使用して、穴の端を滑らかにし、穴の内側の端に4つの溝を作って、回転中の穴の排水を容易にします。次に、チューブを 70% エタノールですすぎ、生物学的安全キャビネットで自然乾燥させます。12 mm のパンチングされた粘着性シリコーンゴム ディスクでチューブを UV ランプの下で 40 分間滅菌します。
20分後、露出した表面がすべて滅菌されるようにチューブとディスクの位置を変更します。次に、粘着ディスクから白い裏地をはがします。穴を合わせ、シリコーンゴムをチューブの外側に貼り付けます。
スライスが得られたら、準備したカバーガラスのフォトエッチング面の中央に2マイクロリットルの鶏血漿を置きます。プラズマを少し広げて、直径3〜4ミリメートルのスポットを実現します。次に、滅菌された先端の狭いスパチュラを使用して、準備された脳スライスを持ち上げます。閉じた鉗子を使用して、スライスを持ち上げながらスライスをスパチュラの先端に保持します。へらをカバーガラスのプラズマスポットに接触させ、閉じた鉗子でスライスをカバーガラスに押し込みます。
スライスを置く前にカバーガラスにひよこ血漿の薄層を追加し、スライスを覆うために最小限のトロンビン処理血漿を追加します。スライスが浮いていると、血栓が取り除かれても付着したままになりません。
次に、2.5マイクロリットルの血漿と2.5マイクロリットルのトロンビンを別のチューブに混合します。この混合物2.5マイクロリットルをスライスの上と周りにすばやく置き、ピペットで上下に軽く混ぜます。ローラーチューブに以前に貼り付けられたシリコーンゴム接着剤の露出側から透明なプラスチックカバーを取り外します。次に、ブレインスライスが入ったカバーガラスを接着剤の上に置き、スライスを穴内に合わせます。
接着性を確保するために、カバーガラスを均等に押し下げ、約1分間保持しながら生物学的安全キャビネットに移すことで、親指でカバーガラスに柔らかく均一な圧力をかけます。
漏れずにチューブに接着するためのカバーガラスにかかる圧力は、シーラント内の空気チャネルを排除するのに十分な時間、適切で維持する必要があります。圧力がかかりすぎるとカバーガラスにひびが入ります。
生物学的安全キャビネットで、0.8ミリリットルの完全な神経基底A培地を各チューブに加えます。次に、5%の二酸化炭素と95%の空気混合物を、クランプでしっかりと保持された滅菌綿栓付き牧草ピペットに通します。これを使用して、ローラーチューブを混合ガスで洗い流し、ピペットの周囲からチューブを引き抜くときにチューブをすばやくキャップします。
次に、チューブにスライス番号とラック番号をラベル付けします。チューブをローラーラックに挿入し、幾何学的にバランスが取れていることを確認します。チューブの数が奇数の場合は、バランスをとるためにブランクチューブを追加します。
ラックを摂氏35度のローラーインキュベーターに入れ、ローラーがローラーラックを回転させて培地をチューブの底に保ちます。インキュベーターの前面をボードに持ち上げて、インキュベーターを約5度後ろに傾けます。