神経突起の急速な伸展と形成の開始:機能的ニューロン接続

まず

、リジンでコーティングされた皿内にマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスを組み立てます。

成長

培地を含む胚ニューロンをマイクロ流体ウェルに播種し、マイクロチャネルを通るようにします。

インキュベートしてニューロンの付着と成長を促進し、物理的に孤立したニューロン集団を形成します。

セットアップを分解し、細胞の生存率を維持するために生理食塩水の流れのあるマイクロマニピュレーターチャンバーに皿を置きます。

ニューロンの近くにリジンでコーティングされたビーズを導入し、神経突起または細胞突起が付着してビーズと神経突起の複合体を形成できるようにします。

マイクロマニピュレーターを使用して、吸引を加えて、1つのチャネルからビーズ-神経突起複合体をかみ合います。

この複合体を引っ張って機械的張力を誘発し、神経突起を急速に伸ばします。

これを別のビーズニューロン複合体に導き、2番目のマイクロマニピュレーターで保持します。

神経炎接続の形成を促進するために、両方のビーズを所定の位置に保ちます。

吸引を解放し、生理食塩水を培地と交換します。

イン

キュベートしてニューロン間の機能的接続を確立し、神経伝達物質を介したコミュニケーションを促進します。

ウェルを空にせずに、マイクロ流体デバイスの上部ウェルから培地を取り除きます。次に、20マイクロリットルの濃縮細胞溶液をマイクロ流体デバイスの右上のウェルに加え、細胞が単一集団マイクロ流体デバイス内でどのように流れているかを顕微鏡で確認します。

複数の集団のデバイスに細胞をプレーティングするには、20マイクロリットルの濃縮細胞溶液を各上部ウェルに加えます。顕微鏡下で、細胞がチャンバー内にあるかどうかを確認します。その後、デバイスをインキュベーターに15〜30分間入れて、基質への細胞の付着を促進します。

細胞が基質に付着した後、40マイクロリットルのNBMを単一集団デバイスの2つの上部ウェルに加えます。これにより、マイクロチャネルから気泡を除去できます。20マイクロリットルのNBMを、細胞が注入されたのと同じウェルである複数集団デバイスの上部ウェルに追加します。メディアはわずかに突き出て正のメニスカスを形成し、ウェルにマフィントップの側面を与える必要があります。

マイクロ流体デバイスを取り外す1〜2日前に、各サンプルディッシュに2ミリリットルの予熱したNBMを加え、チャンバーを浸水させます。次に、デバイスをインキュベーターに保管します。その後、滅菌ピンセットとピペットチップを使用して、カバーガラスからマイクロ流体デバイスを取り外し、ニューロンのパターン化された構成を残します。

この手順では、調製したPDLコーティングビーズを40〜60マイクロリットルを細胞培養に加えます。次に、サンプルをインキュベーターに1時間戻して、シナプス接触の形