神経突起の急速な伸展と形成の開始:機能的ニューロン接続

、リジンでコーティングされた皿内にマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスを組み立てます。

培地を含む胚ニューロンをマイクロ流体ウェルに播種し、マイクロチャネルを通るようにします。

インキュベートしてニューロンの付着と成長を促進し、物理的に孤立したニューロン集団を形成します。

セットアップを分解し、細胞の生存率を維持するために生理食塩水の流れのあるマイクロマニピュレーターチャンバーに皿を置きます。

ニューロンの近くにリジンでコーティングされたビーズを導入し、神経突起または細胞突起が付着してビーズと神経突起の複合体を形成できるようにします。

マイクロマニピュレーターを使用して、吸引を加えて、1つのチャネルからビーズ-神経突起複合体をかみ合います。

この複合体を引っ張って機械的張力を誘発し、神経突起を急速に伸ばします。

これを別のビーズニューロン複合体に導き、2番目のマイクロマニピュレーターで保持します。

神経炎接続の形成を促進するために、両方のビーズを所定の位置に保ちます。

吸引を解放し、生理食塩水を培地と交換します。

キュベートしてニューロン間の機能的接続を確立し、神経伝達物質を介したコミュニケーションを促進します。

ウェルを空にせずに、マイクロ流体デバイスの上部ウェルから培地を取り除きます。次に、20マイクロリットルの濃縮細胞溶液をマイクロ流体デバイスの右上のウェルに加え、細胞が単一集団マイクロ流体デバイス内でどのように流れているかを顕微鏡で確認します。

複数の集団のデバイスに細胞をプレーティングするには、20マイクロリットルの濃縮細胞溶液を各上部ウェルに加えます。顕微鏡下で、細胞がチャンバー内にあるかどうかを確認します。その後、デバイスをインキュベーターに15〜30分間入れて、基質への細胞の付着を促進します。

細胞が基質に付着した後、40マイクロリットルのNBMを単一集団デバイスの2つの上部ウェルに加えます。これにより、マイクロチャネルから気泡を除去できます。20マイクロリットルのNBMを、細胞が注入されたのと同じウェルである複数集団デバイスの上部ウェルに追加します。メディアはわずかに突き出て正のメニスカスを形成し、ウェルにマフィントップの側面を与える必要があります。

マイクロ流体デバイスを取り外す1〜2日前に、各サンプルディッシュに2ミリリットルの予熱したNBMを加え、チャンバーを浸水させます。次に、デバイスをインキュベーターに保管します。その後、滅菌ピンセットとピペットチップを使用して、カバーガラスからマイクロ流体デバイスを取り外し、ニューロンのパターン化された構成を残します。

この手順では、調製したPDLコーティングビーズを40〜60マイクロリットルを細胞培養に加えます。次に、サンプルをインキュベーターに1時間戻して、シナプス接触の形成を促進します。続いて、サンプルを実験セットアップに設置して、細胞を2つのマイクロピペットで上から評価し、光学的にアクセスできるようにします。この構成では、CCDカメラは画像キャプチャ用の顕微鏡のサイドポートに配置されます。生理食塩水で満たされた各ピペットを1ミリリットルのシリンジに接続します。次に、サンプルを生理食塩水で灌流します。

次に、顕微鏡下で、2つの孤立したニューロン集団間のギャップをチェックして、2つの集団が自然に接続されていないことを確認します。視野内のニューロンに付着していないPDLビーズを選択します。ビーズに焦点を合わせ、次にマイクロピペットに焦点を合わせて、ビーズをマイクロピペットの先端に合わせます。

その後、顕微鏡で観察し、先端をビーズにできるだけ近づけます。次に、ピペットに負圧を加えてビーズをピックアップし、実験中ずっと負圧を維持します。

次に、視野内のニューロンに取り付けられたPDLビーズを選択し、吸引を使用して2番目のマイクロピペットに取り付けます。マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージのいずれかを毎分0.5マイクロメートルで1マイクロメートルでゆっくりと動かしてPDLビーズニューロン複合体を引っ張り、神経突起の開始を可能にするために5分間一時停止します。

PDLビーズニューロン複合体を2マイクロメートルにわたって毎分0.5マイクロメートルでゆっくりと横方向に動かして引っ張ります。次に、神経突起が伸長するまで5分間一時停止します。最初の5マイクロメートルの開始と神経突起の伸展が成功した後、毎分20マイクロメートルで神経突起を引っ張り続けます。

ニューロンをつなぐには、神経突起が豊富な領域を選択します。他のビーズを使用して、カバーガラスより上のピペットチップの高さを測定し、PDLビーズ-神経突起複合体を下げて、神経突起に物理的に接触させます。2番目のマイクロピペットを操作しながら、PDLビーズ-神経突起複合体を標的神経突起と接触させたままにします。次に、2番目のPDLビーズを装着した2番目のピペットを、新しく形成された神経突起の上に最初のビーズから約20マイクロメートル下げ、2番目のPDLビーズを使用して、新しい神経突起フィラメントを標的細胞に向かって押し出します。

次に、両方のビーズを少なくとも1時間所定の位置に保持します。局所的な腫れ、ビーズと接触する神経突起の肥厚が顕微鏡でないことを確認します。この間、サンプルの媒体を生理食塩水から予熱した二酸化炭素平衡NBMにゆっくりと変更します。

吸引を解放して、2番目のピペットからビーズを解放します。新しい神経突起が付着したままの場合は、最初の速度も放します。その後、サンプルを慎重にインキュベーターに戻し、将来の実験のためにニューロンの接続を強化します。