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グリア細胞に由来する原発性脳腫瘍であるヒト神経膠芽腫組織を考えてみましょう。
氷冷処理培地を使用して組織を洗浄し、残留血液を除去します。
組織を細かく切り、溶融アガロースを含む包埋型に挿入します。
金型を冷却し、アガロースが重合して安定したゲルマトリックスを形成します。
型から組織ブロックを取り出し、ビブラトームの標本プレートに固定します。
氷のように冷えた処理媒体を加えてブロックを沈めます。酸素化ガス混合物を通して培地に通気し、組織の生存率を維持します。
埋め込まれた腫瘍組織を薄いスライスに切断します。
スライスを氷冷処理培地を含むシャーレに移して、組織構造を保存します。
次に、スライス培養維持培地を含むウェル内の透過性メンブレンインサートに組織スライスをプレーティングします。
スライスを生理学的条件に維持します。スライス培養は、下流のアッセイの準備ができています。
まず、滅菌鉗子を使用して、ウェルあたり1ミリリットルのスライス培養維持培地を含む6ウェルプレートの各ウェルに空のPTFE培養インサートを配置します。すべてのインサートが追加されたら、プレートを摂氏37度、5%CO2の加湿ウォータージャケット付き組織培養インキュベーターに入れます。
次に、腫瘍組織片を氷冷処理培地を含むシャーレに入れ、ピペットを使用して組織を新鮮な培地で3回穏やかに洗浄し、付着した赤血球を除去します。3回目の洗浄後、メスを使用して腫瘍片を約3×3×10ミリメートルのストリップに切断し、付着した血管を慎重に取り除き、壊死または焼灼された組織を避けます。
すべての組織がトリミングされたら、摂氏37度の液体アガロースを5〜7ミリリットルを2立方センチメートルのプラスチック包埋型に加え、アガロースを氷のベッドで1分間冷却します。長軸を垂直に向けた状態で、2〜4本の組織ストリップをアガロースに入れ、配置後さらに2〜5分間組織を氷上に放置します。
アガロースが固まったら、メスでフォームの側面を切り取って型からアガロースをそっと取り除き、シアノアクリレート接着剤をたっぷりと使用してアガロースブロックをビブラトーム標本プレートに固定します。
接着剤が固まったら、アガロースブロックを氷冷処理培地に浸し、トリミングされた滅菌プラスチックピペットを使用して、5%CO2 95%O2混合物をビブラトームリザーバー内の培地に泡立てます。ビブラトームスライスの厚さを300〜350ミクロンに設定し、組織の一貫性とビブラトームの仕様に応じてブレードの高度な速度とブレードの振幅を調整します。
計画された実験分析に従って、適切な数のスライスを取得します。ステンレス製のマイクロスパチュラを使用して、スライスを氷冷加工媒体を含むペトリ皿に移します。すべてのスライスが取得されたら、マイクロスパチュラを使用して各スライスを単一のPTFEインサートに移します。
12〜24時間のインキュベーション後、新鮮なスライス培養維持培地を含む新しい6ウェルプレートを細胞培養インキュベーターで15分間平衡化します。次に、滅菌鉗子を使用して各インサートの縁をつかみ、インサートを新しい6ウェルプレートの個々のウェルに移します。