ヒト血液脳関門の三重細胞培養モデルの開発

ウェル

インサートの下側に周皮細胞を追加することから始めます。

ウェルインサートを培養プレートで覆い、インキュベートします。

周皮細胞はウェルインサートの膜に付着し、単細胞層または単層

を形成します。

別の培養プレートを取ります。

ヒト星状細胞を適切な培地のウェルに加えます。次に、プレートをインキュベートします。

アストロサイトは井戸の底に付着し、単層を形成します。

培地を廃棄し、新鮮な星状細胞と周皮細胞培地を追加します。

次に、周皮細胞層を備えたウェルインサートを含む培養プレートを取ります。

プレートを反転させ、ウェルインサートをアストロサイト層を含むウェルに移します。

ヒト脳内皮細胞をウェルインサートの上側に加え、インキュベートします。

内皮細胞はウェルインサートに付着し、血流と脳を分離する重要な界面である血液脳関門に似た三重細胞培養システムを形成します。

まず

、細胞接着のために活性化された表面を備えたT75培養フラスコで、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーター内で合流するまでHBVPを培養します。合流点に達したら、古い寄生虫培地を吸引し、5ミリリットルの温かいダルベッコPBSで細胞を洗浄します。4ミリリットルの温かいトリプシン-EDTA溶液と1ミリリットルのダルベッコPBSを組み合わせて、ダルベッコのPBSを吸引し、フラスコから細胞を切り離します。

フラスコを二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で5分間インキュベートします。顕微鏡で観察し、細胞がフラスコから剥がれているかどうかを確認します。2%FBSを含む5ミリリットルの温かい寄生虫培地をフラスコに加え、切り離した細胞を50ミリリットルの遠心分離管に移します。細胞懸濁液を200gで3分間遠心分離し、細胞がチューブの底にペレットを形成できるようにします。

チューブから培地を吸引し、細胞ペレットが無傷のままであることを確認します。細胞ペレットを寄生虫培地に再懸濁します。細胞の合流点と必要なウェルインサートの数に応じて、培地の量を計算します。再懸濁した細胞を10マイクロリットル取ります。それらを細胞カウントスライドに配置し、細胞の数を数えます。

細胞密度を測定し、インサートあたり300,000個の細胞を1ミリリットルの寄生虫培地にウェルインサートの管腔側に播種します。テキスト原稿に記載されているように、2%FBSを含むアストロサイト培地を使用して初代ヒトアストロサイトを培養します。細胞密度を測定し、ウェルあたり300,000個の細胞を組織培養6ウェルプレートの底に播種します。蒸発を防ぐためにプレートを覆い、一晩インキュベートします。

周皮細胞を含むウェルインサート内のアストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。組織培養6ウェルプレートからアストロサイト培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの寄生虫培地と1ミリリットルのアストロサイト培地を加えます。

ウェルインサートから周皮細胞培地を吸引し、播種された星状細胞を含む組織培養6ウェルプレートに入れます。HBMECをウェルあたり300,000細胞の密度で、2ミリリットルの完全なクラシック培地に同じウェルインサートの頂端側に播種します。