膠芽腫細胞の3次元培養のためのヒアルロン酸ベースのハイドロゲル

神経

膠腫球、脳腫瘍または神経膠芽腫に由来する細胞凝集体から始めます。

解離酵素を加えます。インキュベートして神経膠芽腫細胞を分離し、単一細胞懸濁液を得る。

次に、血清が豊富な培地を導入して酵素活性を停止します。

遠心分離して上清を除去し、細胞を再懸濁します。

懸濁液をろ過し、遠心分離して上清を除去します。

小さなペプチドを含むヒドロゲル前駆体に細胞を再懸濁します。

この混合物を、ヒアルロン酸を含む組み立て済みのシリコン型でウェルに入れます。

溶液を混ぜます。ヒアルロン酸とヒドロゲル前駆体の間の相互作用を可能にするためにインキュベートし、細胞の閉じ込めを促進するヒドロゲルを形成します。

細胞の生存を維持するために、ヒドロゲルを培地でオーバーレイします。

金型を分解した後、ヒドロゲルをインキュベートします。

ヒドロゲル内では、細胞上の接着タンパク質が前駆体ペプチドやヒアルロン酸と相互作用します。

これにより、細胞が小さなクラスターを形成し、3次元培養が発達します。

まず、清潔で乾燥したシリコーンゴム型を非組織培養処理の12ウェルプレートの各ウェルに入れ、ピペットチップのきれいな鈍い端を使用して型をプレートの底に接着します。型と井戸底の間のシールを確認した後、神経膠芽腫細胞培養物から解離した神経膠腫球を遠心分離によって収集し、ペレットを1ミリリットルの細胞解離酵素に再懸濁します。

室温で5分間後、チューブを軽くたたきながら撹拌し、4ミリリットルの完全培地で酵素反応を停止します。細胞を再度遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁してから、70マイクロメートルのフィルターを通して細胞を濾します。ストレーナーをさらに4ミリリットルの完全培地で洗浄し、懸濁液を遠心分離管あたり8 x 10⁴セルの2つのアリコートに分割します。

遠心分離によって細胞を収集し、1つのペレットを80マイクロリットルの新しく調製したポリエチレングリコールマレイミド(PEG-Mal-RGD)に再懸濁し、1つのペレットを80マイクロリットルの新たに調製したPEG-Mal-CYS溶液に1つのペレットを金型あたり再懸濁します。200マイクロリットルのワイドオリフィスマイクロピペットチップを使用して、40マイクロリットルのヒアルロン酸溶液を各ゴムシリコンモールドに加え、続いて40マイクロリットルのPEG-Mal-CYSまたはPEG-Mal-RGD細胞溶液を加え、金型ごとに10回以内に素早く上下にピペッティングして混合します。

ゲル化時間が速いため、2つのヒドロゲル成分が混合されたら、幅の広いオリフィスのピペットチップを使用して溶液を迅速かつ完全に混合することが重要です。このステップには練習が必要です。

次に、ゲルカプセル化された細胞を摂氏37度および5%CO₂細胞培養インキュベーターに5〜10分間入れます。インキュベーションの最後に、各ゲルに2〜2.5ミリリットルの培地を加え、滅菌済みの2マイクロリットルのピペットチップと鉗子を使用して、ゲルを型の側面から穏やかに分離します。次に、滅菌鉗子を使用してプレートウェルから型を取り出し、プレートを細胞インキュベーターに戻します。