JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 5:12 分 • July 8th, 2025
ネズミの子犬の脳から始めます。
小脳を単離し、適切な厚さの組織スライスを取得します。
スライスを培地を含む培養プレートウェル内に配置されたメンブレンインサートに移します。
処理されたウェルでは、培地には神経保護試験化合物が含まれています。コントロールウェルには化合物が欠けています。インキュベート。
対照条件下では、小脳プルキンエ細胞はアポトーシスを起こし、生後早期の生後発生を模倣します。
処理されたウェルでは、その可能性に応じて、化合物は細胞をアポトーシスから保護する可能性があります。
スライスを洗浄し、細胞の完全性を維持するために固定します。
スライスを透過処理遮断溶液に移して、細胞膜を透過処理し、非特異的結合部位をブロックします。
プルキンエ細胞で特異的に発現するカルシウム結合タンパク質を標的とする一次抗体との重ね合わせ。
一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体を洗浄して導入します。
DNA結合色素で核を対比染色し、スライスをマウントします。
共焦点顕微鏡を使用して、生存可能なプルキンエ細胞を定量し、試験化合物の神経保護能を特定します
小脳を採取するには、まっすぐな包帯鉗子を使用して子犬の頭を鼻でつかみ、まっすぐな目はさみを使用して頭皮を後端から正中線まで横方向に切り開きます。小脳の損傷を避けるためにハサミの先端を外側に向けて、同じ方法で頭蓋骨を切り開き、へらを使用して、冷たいHBSSとブドウ糖1ミリリットルあたり5ミリグラムの入った60ミリメートルの皿に脳を移します。
ストレートドレッシング鉗子を使用して小脳を注意深く解剖し、滅菌された湾曲した細い鉗子を使用して、組織チョッパーの切断テーブル上のプラスチックディスクに組織を置きます。カッティングテーブルを回転させて組織の向きを変えて矢状傍切片を取得できるようにし、テーブルリリースノブを右に引いてカッティングテーブルを動かし、ブレードが組織の端に配置されるまでカッティングテーブルを動かします。次に、スライスの厚さを 350 マイクロメートルに、ブレードの速度を中程度に調整して、チョッパーを始動します。小脳全体がスライスされたら、チョッパーの電源を切ります。
滅菌鉗子を使用して、新しい60ミリメートルの皿の上にディスクを保持します。トランスファーピペットを使用して、HBSSとグルコースをディスク上で洗い流し、スライスが皿に落ちるようにします。次に、サンプルへの接触をできるだけ少なくし、マイクロプローブを使用してスライスを分離します。
トランスファーピペットを使用して、虫部に近い小脳の切片を6ウェルプレート内の個々の細胞培養インサートに選択し、マイクロプローブを使用してスライスを各インサートの中央に配置します。すべてのスライスが配置されたら、余分なHBSSとグルコースを慎重に吸引し、プレートを細胞培養インキ
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