脳腫瘍細胞懸濁液からのオルガノイド培養物の生成

ラミニンが豊富な細胞外マトリックスまたはlrECMを含む微量遠心チューブから始めます。ラミニンは脳内に豊富に存在する構造成分です。

IrECMの重合を防ぐために、チューブを氷の上に置いてください。

脳腫瘍細胞を加え、細胞が均一に分布するようによく混合します。

次に、混合物をパラフィルム型に移し、液滴を形成します。

イン

キュベートしてlrECM重合を促進し、細胞の自然環境を模倣して足場を形成します。

次に、固化したオルガノイドを培地を含むペトリ皿に洗い流し、インキュベートします。

培

地は必須栄養素と成長因子を提供し、細胞分裂をサポートします。

オルガノイド内では、細胞は移動と侵入によって自己組織化します。

インキュベーション後、プレートを傾けてオルガノイドを沈殿させます。

余分な培地を慎重に取り除き、新鮮な培地を追加します。

穏やかに振ってインキュベートします。

これにより栄養素が均一に分配され、オルガノイドの成長が促進されます。

単一細胞懸濁液からオルガノイドを作るには、適切な量のラミニンが豊富な細胞外マトリックスまたはlrECMを、アイスバケツまたはコールドブロック内の小さな遠心分離管に加えます。

オルガノイドあたり20,000個の細胞を含む細胞混合物を調製します。lrECM細胞懸濁液混合物を完全に混合して、細胞が沈降しないようにし、オルガノイドの形成が不均一になります。次に、20マイクロリットルの混合物をパラフィルム型に慎重にピペットで入れて、真珠のような液滴を形成します。lrECMの重合を防ぐために、2〜3個のオルガノイドごとにピペットチップを冷却してください。

必要な数のオルガノイドを10センチメートルの培養プレート内のパラフィルムモールドにピペットでピペッティングしたら、オルガノイドを細胞培養インキュベーターで摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。オルガノイドが固化したら、P1000チップを使用してNBMC培地でパラフィルムモールドからオルガノイドをそっと洗い流し、20ミリリットルのNBMCを含む新しい10センチメートルの培養プレートに集めます。培養プレートを振らずにインキュベーターに4日間入れます。

4日後、プレート内のメディアを交換します。これを行うには、細胞培養プレートの下に暗い紙を置きます。プレートを傾けて20秒待ちます。オルガノイドが皿の底に完全に落ち着いたら、大きな開口部のガラスピペットで培地をゆっくりと取り除きます。

新しい培地を追加した後、プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーに80RPMで置き、その後2〜3日ごとに培地を交換します。