ヒト胚性幹細胞のオリゴデンドロサイトへの分化

まず

、ヒト胚性幹細胞をマトリックスでコーティングされたマルチウェルプレートに播種します。

マトリックス環境は、特殊な細胞への時期尚早の成熟を防ぎます。

ジメチルスルホキシドまたはDMSOを添加した適切な維持培地を追加します。

DMSO処理は、成熟シグナルに対する細胞の反応を高めます。

次に、培地を特定の阻害剤を含む神経誘導培地に置き換えます。

阻害剤は非神経細胞発生のシグナルをブロックし、幹細胞を神経前駆細胞またはNPCに形質転換するように誘導します。

培地を剥離溶液に置き換えて、NPCを解離させます。必要な数の細胞を別のマルチウェルプレートに再プレートします。

DMSOを添加した細胞特異的分化培地を添加して、NPCのオリゴデンドロサイト前駆細胞またはOPCへの形質転換を促進します。

培地を細胞特異的成熟培地に置き換えて、OPCのオリゴデンドロサイトへの発達を促進します。

神経前駆細胞の生成を行うには、テキスト原稿に記載されているように、H1ヒトES細胞を培養し、それらを神経前駆細胞に分化転換します。陰性1日目に、ES細胞維持培地中の0.5〜100万個の細胞を成長因子還元マトリックス溶液でコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに播種します。

0日目に、2%DMSOを添加したES細胞維持培地で細胞を24時間処理します。1日目から6日目に、市販のキットからSMAD阻害剤を含む温かい神経誘導培地でフル培地を交換します。7日目に、細胞剥離溶液を使用してNPCを継代し、24ウェルプレートのウェルあたり1〜2 x 10⁵細胞の座密度でプレートします。

オリゴデンドロサイト前駆細胞を生成するには、市販のキットのSMAD阻害剤を含む温かい神経誘導培地にNPCをプレートします。8日目に、OPC分化培地で1%DMSOの溶液を調製し、プレーティングしたNPCを24時間処理します。9日目に、培地をDMSOを含まない新鮮なOPC分化培地に交換し、15日目まで1日ごとに細胞に給餌します。

細胞が15日目より前に合流に達する場合は、ウェルあたり1〜2 x 10⁵細胞の播種密度に細胞を継代します。14日目に、OPCを24ウェルプレートのウェルあたり1〜2 x 10⁵細胞の密度でOPC分化培地にプレートします。15日目に、培地をOL成熟培地に交換します。

媒体は一日おきまたは毎日交換してください。細胞が90%のコンフルエンスに達したら、最大2回の継代で、または細胞分裂が大幅に遅くなるまで、1対3の比率で分割します。OPCの分裂が速すぎて3日以内にコンフルエントに達する場合は、2〜5マイクロモルの濃度でAra-Cを1〜3日間添加します。