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着基底膜マトリックス上で培養したヒト人工多能性幹細胞コロニーから始めます。
特定のホルモン、成長因子、および低分子阻害剤を含む小脳分化培地を追加します。
ガラスピペットを使用してコロニーを持ち上げ、超低取り付けプレートに移します。
低付着表面は細胞を懸濁状態に維持し、三次元胚様体(EB)への凝集を促進します。
ホルモン、成長因子、阻害剤はそれぞれの標的部位に結合し、幹細胞のニューロン前駆細胞への分化を促進します。
EBの付着を促進するために、合成ポリマーと接着タンパク質でコーティングされた培養プレートウェルにEBを移します。
培地を阻害剤を含まない分化培地に交換します。
細胞はEBから外側に移動し始め、2D単層を形成します。
培地を取り除き、小脳成熟培地を加えます。
培地中の成長因子は、神経前駆細胞の成熟を誘導して、異なる小脳ニューロン前駆体にします。
0日目に、10マイクロモルのY27632を添加し、6ウェル超低アタッチメントまたはULAプレートの各ウェルにSB431542を添加した小脳分化培地1ミリリットルを加え、持ち上げられたコロニーをウェルに追加する準備ができるまでインキュベーターに入れます。プルガラスピペットを使用して分化した細胞を洗浄します。培地を吸引し、35ミリメートルの皿ごとに1ミリリットルのiPS細胞継代溶液を加えます。
摂氏37度で3分間インキュベートした後、培地を吸引し、10マイクロモルのY27632とSB431542を添加した2ミリリットルの小脳分化培地を加えます。透過光倒立顕微鏡の4倍倍率で、引っ張ったガラスピペットの曲がった端を使用してコロニーを持ち上げます。すべてのコロニーが持ち上げられたら、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、すべてのコロニーを6ウェルULAプレートの1つのウェルに穏やかに移します。各iPS細胞プレートに対してこのプロセスを繰り返し、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素とともにインキュベートします。
2日目に、FGF2を各ウェルに添加して、最終濃度を50ナノグラム/ミリリットルに調整します。7日目に、使用済み培地1ミリリットルを吸引し、新鮮な小脳分化培地1ミリリットルと交換して培地の3分の1を交換します。胚様体を7日間インキュベートします。
14日目に、プレートを回転させて、プレートの中央にすべての胚様体を集めます。次に、プレートを傾け、1000マイクロリットルのピペッターを使用して使用済み培地をすべて端から吸引します。培地量が減少したら、プレートをゆっくりと平らに置き、胚体が乾燥しないように十分な培地を残して吸引を続けます。
次に、10マイクロモルを添加した3ミリリットルの新鮮な小脳分化培地を追加します。Y27632です。次に、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して胚様体をポリ-L-オルニチンラミニンコーティング皿に移します。15日目に、培地を吸引し、新鮮な小脳分化培地と交換します。