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ネズミの子犬セレベラを例にとります。
それらをより小さな断片に均質化します。
タンパク質分解酵素を加えて組織の細胞外マトリックスを消化し、小脳顆粒前駆細胞(CGNP)と星状細胞を緩めます。
血清を含むCGNP培地を加えて酵素活性を止めます。酵素が豊富な上清を遠心分離して廃棄します。
組織断片をCGNP培地に再懸濁します。組織を機械的に解離して細胞を放出します。
破片が落ち着いたら、細胞を含む上清を新しいチューブに移します。
遠心分離し、破片で上清を取り除きます。
細胞をCGNP培地に再懸濁し、ポリ-D-リジンでコーティングされたマルチウェルプレートウェルに播種します。インキュベート。
アストロサイトは、CGNPと比較して、ポリ-D-リジンコーティングに沈降し、強く付着します。
プレートを振って、CGNPを含む上清を回収します。遠心分離して上清を除去します。
CGNPをCGNP培地に再懸濁し、ポリ-L-オルニチンでコーティングされたマルチウェルプレートに播種します。インキュベート。
CGNPはコーティングされた表面に付着し、培地成分とポリ-L-オルニチンの助けを借りて増殖します。
3〜5個の小脳を15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離前にHBSSグルコースで小脳を洗浄します。チューブを遠心分離して組織を収集します。最終洗浄後、断片のサイズが0.5〜1立方ミリメートルになるまで、1ミリリットルのピペットで2〜3回静かに上下にピペッティングして小脳を均質化します。
2.5ミリリットルが残るまで、すべての液体をそっと取り除きます。次に、脳を含むHBSSグルコースを含むチューブに0.05%トリプシンを加え、組織を摂氏37度のウォーターバスで15分間インキュベートします。1〜3分ごとに組織を反転させます。インキュベーション後、5ミリリットルのcGMP細胞培養培地またはCGMを加えて消化を停止し、以前と同様に遠心分離して組織を回収します。
遠心分離後、上清を取り除き、1ミリリットルCGMを加えます。気泡の形成を避けながら、1ミリリットルのピペットチップで組織を粉砕します。次に、5ミリリットルのCGMを加え、混合物を氷上で2分間インキュベートして組織の残骸を沈殿させます。組織が落ち着いたら、上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。次に、残存組織に2ミリリットルのCGMを加え、上清を採取して組織残骸を廃棄する前に粉砕手順を繰り返します。
組織の各15ミリリットルチューブから上清をプールし、遠心分離して小脳細胞を収集します。ペレットを10ミリリットルのCGMに再懸濁します。アストロサイトはcGMPよりもポリ-D-リジンに速く強く付着するため、ポリ-D-リジンでコーティングされた6ウェルプレートのウェルに最大4ミリリットルの細胞懸濁液を加え、摂氏37度で20分間インキュベートしてアストロサイトを除去します。
プレートを振ってください。上清を15ミリリットルのチューブに集め、前と同じように上清を遠心分離します。ペレットを10ミリリットルのCGMに再懸濁し、ノイバウアー計数チャンバーで細胞を計数します。4〜6時間後、接着したcGMPは丸く見え、増殖します。ポリ-L-オルニチンでコーティングされたプレート上のCGMに細胞を播種し、摂氏37度、5%CO2、および100%相対湿度でインキュベートします。