ヒト多能性幹細胞からのスフェロイドの作製

培養

培地中の適切な基質に結合したヒト多能性幹細胞またはhPS細胞のコロニーから始めます。

培地を取り除きます。特定の阻害剤を含むニューロン培地を加えてインキュベートします。

これらの阻害剤は、hPS細胞の成熟をニューロン系統に向け、神経外胚葉コロニーを形成します。これらは、スフェロイドと呼ばれる小さな球形構造の前駆体です。

培地を取り出し、塩緩衝液で洗浄します。

消化酵素でインキュベートして、コロニーをプレートから切り離します。

ニューロン培地を加えて酵素活性を停止します。

コロニーを集めてチューブに移します。

それらを沈殿させてから、上清を捨てます。

成長因子を含むニューロン培地にコロニーを再懸濁します。

コロニーをマルチウェルプレートに移し、インキュベートします。

この成長因子は神経外胚葉細胞の自己組織化と増殖を促進し、スフェロイド

を形成します。

まず、hPSCコロニーをhESC認定基底膜マトリックス上に60%コンフルエントで60%のコンフルエントで3つのウェルにプレートして20%〜30%の密度を達成し、次に、2D神経外胚葉コロニーの誘導を進めます。

デュアルSMAD阻害剤を添加した新鮮なN2培地を、次の3日間、毎日各ウェルに加えます。誘導された2D神経外胚葉コロニーから3D神経外胚葉スフェロイドを生成するには、6ウェルプレートから2ミリリットルのN2培地を除去し、HBSSで1回洗浄して、すべてのN2培地が除去されるようにします。

各

コロニー含有ウェルに1ミリリットルのディスパーゼを加えます。プレートを摂氏37度で20〜25分間インキュベートし、コロニーの剥離を定期的にチェックします。インキュベーションの最後に、ディスパーゼ酵素の活性を停止するために、1ミリリットルのN2培地をウェルに加えます。広口径のP1000ピペットチップまたは滅菌ハサミ付きの改良型P1000ピペットチップカップを使用して、コロニーを15ミリリットルのチューブに移し、コロニーの塊を重力でチューブの底に沈

めます。

次に、標準のP1000ピペットチップを使用して、上清を慎重に取り除きます。1ミリリットルの新鮮なN2培地と交換し、3回洗浄を繰り返して、分散酵素を完全に除去します。細胞塊とN2培地を再懸濁した後、細胞懸濁液を6ウェルプレートの1つのウェルに移し、bFGFミリリットルあたり40ナノグラムを加えます。