網膜神経節ニューロンと嗅覚被覆グリアの共培養

網

膜神経節ニューロン(RGN)を含む目の感光層であるラットの網膜を考えてみましょう。

組織の損傷を防ぐために、網膜を低温バランスのとれた塩溶液に入れます。

網膜をプロテアーゼとDNaseを含む溶液に移し、細かく切ります。

内容物をチューブに移し、インキュベートします。

プロテアーゼは細胞外マトリックスを分解して細胞を緩め、DNaseは汚染されたDNAを分解します。

細胞の塊を分散させるために上下にピペットで移動します。

阻害剤溶液を加えてプロテアーゼ作用を停止します。

細胞を遠心分離して沈降させます。上清を取り除き、細胞を適切な増殖培地に再懸濁します。

この細胞懸濁液を、グリア細胞の一種である嗅覚エンシーンググリアまたはOEG細胞の単層に加え、インキュベートします。

RGNはOEG単層に統合され、OEGの神経再生能を評価するための共培養モデルを確立します。

網

膜を、5ミリリットルの冷たいEBSSとともに事前に準備したP-60細胞培養皿に入れます。次に、再構成したパパインと50マイクロリットルのAPVおよび250マイクロリットルのDNaseと5マイクロリットルのAPVを入れたP-60細胞培養皿に移します。

メ

スで網膜を細かく切ります。破片を15ミリリットルのプラスチックチューブに移し、10分ごとに撹拌しながら5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで30分間インキュベートします。ガラス製パスツールピペットで上下にピペッティングして細胞塊を解離します。次に、細胞懸濁液を200倍gで5分間遠心分離します。

上清を廃棄し、150マイクロリットルのDNaseと30マイクロリットルのAPVを含むアルブミンオボムコイドプロテアーゼ阻害剤に細胞ペレットを再懸濁します。

慎重に

、5ミリリットルのアルブミンオボムコイドプロテアーゼ阻害剤に細胞懸濁液を加え、遠心分離を繰り返します。遠心分離中に、OAG 24ウェルプレートからME-10培地を完全に除去し、ウェルあたり500マイクロリットルのNBB-27培地と交換します。

上清を廃棄し、細胞を2ミリリットルのNBB-27培地に再懸濁します。100マイクロリットルの網膜細胞懸濁液をM24プレートの各ウェルにPLL処理またはOEG単層カバーガラスにプレートします。

NBB-27培地で5%の二酸化炭素を含む摂氏37度で96時間培養を維持します。