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ラットの頭の筋肉から始めて、それを断片に切り刻
みます。タンパク質分解酵素のカクテルを加え、穏やかに振ってインキュベートします。
酵素は組織の細胞外マトリックスを消化し、筋線維を緩めます。
血清タンパク質を含む培地を加えて酵素を不活性化します。
組織をチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄します。
組織を培地に再懸濁します。機械的破壊と遠心分離を2回繰り返して、サテライト細胞(筋肉の修復と再生に不可欠な幹細胞)の均質な懸濁液を得る。
サテライトセル含有上清を採取します。
細胞ストレーナーを通過して、単一細胞懸濁液を得る。遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を培地に再懸濁します。
細胞懸濁液の滴を細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたチャンバースライドウェルに置きます。
コーティングされた表面は、サテライトセルの取り付けを容易にします。ウェルに培地を追加します。
培地中の成長因子は、サテライト細胞の増殖と筋芽細胞(筋細胞前駆体)への分化を誘導し、さらに増殖して融合して多核筋管を形成します。
筋管は最終的に筋線維に成熟します。
サテライト細胞を単離するには、各筋肉を6ウェルプレートの個々のウェルに移し、筋肉を細かく刻みすぎないように注意しながら、組織を2ミリメートルの小さな断片に切断します。次に、組織断片をウェルあたり2.5ミリリットルの0.1%プロナーゼ溶液で摂氏37度で60分間、20分ごとに穏やかに振とうしながら慎重にインキュベートします。
繊維束が緩んだ外観を示したら、馬血清と抗生物質を添加した2.5ミリリットルのDMEMを各ウェルに加え、消化された組織を個々の15ミリリットルの円錐形チューブに移します。組織スラリーを回転させ、上清をデカントします。次に、各チューブに5ミリリットルの培地を加え、10ミリリットルのプラスチックピペットで組織を均質化します。
組織を再び回転させ、上清を新しい15ミリリットルの円錐形のチューブに移します。次に、さらに5ミリリットルの培地をチューブに加え、断片がピペットを容易に通過するまで組織片を再度粉砕します。
もう一度遠心分離した後、上清を適切な対応するチューブにプールし、細胞懸濁液を40マイクロメートルのストレーナーで個々の50ミリリットルのチューブにろ過します。細胞回収率を最大限に高めるために、ストレーナーを1ミリリットルのDMEMで洗浄します。次に、セルをスピンダウンします。ペレットを新鮮な培地に再懸濁し、細胞をカウントします。
単離されたサテライト細胞を培養するには、次に、細胞懸濁液を培地10マイクロリットルあたり1.5 x 103細胞に希釈します。次に、事前に調製した各細胞外マトリックスゲルスポットに10マイクロリットルの細胞を加え、ゲルを摂氏37度でインキュベートします。6時間後、各ゲルスポットに400マイクロリットルの培地を注意深く加え、スライドをインキュベーターに戻します。3日後、適切な培地を添加して細胞の分化を開始します。