JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 4:02 分 • July 8th, 2025
さまざまな細胞型に分化できるマウス胚性癌細胞懸濁液を取ります。
培地とレチノイン酸を含む疎水性培養皿に細胞を播種します。
インキュベート。疎水性表面は細胞の接着を防ぎ、細胞に凝集体を形成します。
レチノイン酸は細胞凝集体に入り、シグナル伝達経路をトリガーし、神経前駆細胞への分化を引き起こします。
インキュベーション後、細胞凝集体を収集します。
メディアを廃棄します。
レチノイン酸を含む培地を加え、凝集体を疎水性培養皿に播種します。
インキュベート。レチノイン酸は、ニューロンへの持続的な細胞分化を促進します。
アグリゲートを回収し、メディアを取り外します。
タンパク質分解酵素を添加して、凝集体内の細胞間接着を破壊します。
酵素活性を止めるために血清を含む培地を追加します。
凝集体を機械的に解離させ、ニューロン懸濁液を形成します。
酵素が豊富な上清を遠心分離して廃棄します。
ニューロンを培地に再懸濁し、培地を含む接着マルチウェルプレートに播種します。
インキュベート。ニューロンはプレートに付着して成熟し、長い突起を伸ばします。
凝集体を生成するには、まず、5マイクロリットルのRAを添加した10ミリリットルの分化培地を100ミリリットルの未処理培養皿に加えます。培養皿に100万個の細胞を播種し、凝集体形成を促進するために摂氏37度、二酸化炭素5%で2日間インキュベートします。
インキュベーション後、10ミリリットルのピペットで、凝集体を含む培地を吸引し、室温で15ミリリットルのチューブに移します。凝集体が底に沈殿するまで1.5分待ってから、上清を捨てます。
0.5マイクロモルRAを添加した10ミリリットルの新鮮な分化培地を加えます。新しい100ミリメートルの未処理培養皿に凝集体をそっと播種し、摂氏37度、二酸化炭素5%で2日間インキュベートします。
まず、10 ミリリットルのピペットを使用して細胞凝集体を 15 ミリリットルのチューブに移します。凝集体が底に沈殿するまで室温で1.5分間待ってから、上清を廃棄します。凝集体を血清および抗生物質を含まないDMEMで洗浄します。細胞凝集体が底に沈殿するのを待ちます。上清を捨て、2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを加えます。
チューブを摂氏37度のウォーターバスで10分間インキュベートし、2分ごとにタップして細胞を懸濁状態に保ちます。次に、トリプシン活性を停止するために4ミリリットルの維持培地を加え、1ミリリットルのピペットを使用して上下に20回ピペットします。
最後に、細胞を200倍g、室温で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルの維持培地に再懸濁します。セルカウンターを使用してセル番号を決定し、セルのプレーティングを進めます。細胞をプレートするには、まず、ウェルあたり3ミリリットルの維持培地を6ウェル培養プレートに加えます。次に、ウェルあたり500,000の密度で細胞を播種します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。