レチノイン酸を用いた胚様体細胞の神経前駆細胞への分化

幹細胞を

未分化状態に維持する線維芽細胞フィーダー細胞の層上で培養された胚性幹細胞から始めます。

トリプシン酵素とEDTAを添加して、細胞間の接着を破壊し、細胞を剥離します。

その後、血清が豊富な培地を加えて酵素活性を停止し、細胞懸濁液をチューブに移します。

遠心分離して細胞を収集し、上清を除去し、レチノイン酸を含む培地に細胞を再懸濁します。

この細胞懸濁液の液滴を非粘着性培養皿のベースに置きます。

ベースを反転させて垂れ下がった滴を形成し、液滴の乾燥を防ぐために緩衝液で満たされた培養皿の蓋の上に置きます。

ぶら下がっている滴では、重力により細胞が底に沈殿し、最終的に胚様体と呼ばれる三次元構造に凝集します。

さらに、細胞はさまざまな細胞内シグナル伝達経路を調節するレチノイン酸を吸収します。

この調節は、幹細胞がニューロン産生能力を持つ神経前駆細胞に分化することを刺激します。

0.25%トリプシン-EDTAで胚性幹細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で2〜5分間採取することにより、胚様体形成を開始します。新鮮なIscove's Modified Dulbecco's 培地または15%FBSを含むIMDMを剥離細胞に加え、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。

室温で160 x gで5分間遠心分離します。次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントし、0.5マイクロモルのレチノイン酸を含むIMDM中で5 x 10⁵細胞/ミリリットル懸濁液を調製します。次に、8チャンネルピペットと200マイクロリットルのチップを使用して、100ミリリットルのペトリ皿あたり120マイクロリットルの滴をプレートします。皿を裏返し、垂れ下がった滴が乾かないように、逆さまの蓋にPBSを入れます。摂氏37度、2酸化炭素5%で3〜4日間培養します。