オリゴデンドロサイト前駆細胞のin vitro形質導入誘導性髄鞘形成アッセイ

初代オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の接着培養を増殖培地中で採取します。

コントロールレンチウイルスベクターをコントロールウェルに加え、髄鞘形成を調節するシグナル伝達タンパク質をコードするテストベクターをテストウェルに添加し、インキュベートします。

細胞はベクターを内在化し、ウイルスRNAはDNAに逆転写されて宿主ゲノムに組み込まれ、テスト細胞内のシグナル伝達タンパク質を発現します。

酵素を導入して、OPCを基質から分離します。

酵素を中和し、遠心分離して酵素を除去します。

増殖培地を加え、後根神経節またはDRGニューロンが付着したマイクロプレート内のカバーガラスにOPCを移します。OPC が決済されるまで待ちます。

ウェルを成長培地で満たし、インキュベートします。DRGニューロンとの相互作用は、オリゴデンドロサイトへのOPC成熟を引き起こします。

発現したシグナル伝達タンパク質は、オリゴデンドロサイトを誘導してDRGニューロンの周囲にミエリン鞘を形成します。

対照ベクター形質導入細胞と比較して、試験細胞におけるシグナル伝達タンパク質誘発ミエリン鞘形成を評価します。

このプロトコルでは、初代オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)を、CNTF、PDGF、NT3、およびフォルスコリンの成長因子を含む10ミリリットルのSATO培地で10センチメートルのプレートで培養させます。細胞は、24%の二酸化炭素の下で8時間培養されている必要があります。

まず培地を吸引し、完全に取り除きます。次に、成長因子を含む同じ培地10ミリリットルと交換します。OPCにレンチウイルスを感染させ、必要な量のウイルスを培地に滴下して目的のタンパク質を発現させます。

また、別のOPCプレートで、GFPのみを発現する対照レンチウイルスを培地に混合します。細胞をさらに48時間培養し、プレートからOPCを収集して、培養したDRGニューロンに播種します。

まず、各プレートを8ミリリットルのEBSSで2回すすぎます。1ミリリットルのトリプシン-EDTA 0.05%を9ミリリットルの温かいEBSSで構成します。希釈したトリプシンを各プレートに5ミリリットル加えます。摂氏37度で最大2分間インキュベートします。EBSSに5ミリリットルの30%FBSを加えてトリプシンを中和します。

次に、10ミリリットルのピペットを使用して、プレートの表面からOPCを洗浄します。毎回プレートを4分の1回転させて、すべてのセルを集めます。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を室温で180 gで15分間遠心分離します。

次に、上清を吸引し、細胞ペレットを成長因子を含まないミリリットルの温かいSATO培地に再懸濁し、細胞をカウントします。次に、22mmのカバーガラスで培養されるDRGニューロンを、プレートから培地を完全に吸引することにより調製します。

次に、200,000 OPCを各カバーガラスに滴状にそっと播種します。播種量は、カバーガラスあたり 200 マイクロリットル未満でなければなりません。プレートを動かさずに細胞を沈殿させます。10分後、各ウェルに1ミリリットルの温かいSATO培地をトッピングします。次に、残りの姉妹OPCを成長因子を含むSATO培地で再プレーティングします。これらは、後で目的のタンパク質の発現を検証するために使用できます。