ニワトリ胚からの頭蓋神経襞の単離による神経堤細胞培養

ろ紙フレーム内に支えられたひよこの胚を取り出し、解剖顕微鏡下に置きます。

胚を囲む保護膜である卵黄膜を取り除きます。

視神経葉の後方、成熟した心臓の胚前駆体である心臓三日月の前方に位置する中脳神経襞を特定します。

神経襞には、発生中に遊走細胞に形質転換する多能性幹細胞である前回遊性神経堤細胞が含まれています。

これらの遊走細胞は、神経細胞と非神経細胞に分化します。

神経ひだの背側の最上部を切除し、組織を緩衝液を含む培養皿に移します。

次に、接着タンパク質でコーティングされたカバーガラスを培地を含む培養プレートウェルに入れます。

神経のひだをコーティングされたカバーガラスに移します。組織の付着を促進するためにインキュベートします。

培養中、遊走性神経堤細胞が神経ひだからコーティングされた表面に出現し、神経堤細胞培養が確立されます。

リンゲルペン連鎖球菌溶液を含む清潔な皿に胚を移します。胚を前後にそっと振り回して視界を遮る卵黄を取り除き、リンゲルペン連鎖球菌溶液を交換するか、曇った場合は新しい皿に移します。胚の背側とフレーム面を上にして、解剖顕微鏡下に置きます。胚を紙枠の上に置いて、引き伸ばして所定の位置に保持します。

次に、鉗子を使用して卵黄膜を取り除き、神経のひだを露出させます。拡大する視小胞の尾側の組織と、菱形のくびれが現れ始めたばかりの後脳の吻側の組織を含めます。バネハサミを使用して、中脳神経のひだを慎重に切除します。神経管と非神経外胚葉の汚染を最小限に抑えて神経ひだの背側を切除するように注意し、P20ピペッターまたは卵黄リンゲルペン連鎖球菌溶液ですすいだ滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、リンゲルペン連鎖球菌溶液を含む清潔な皿に神経ひだを移します。

追加の折り目を解剖しながら、収集した折り目を氷の上に保管します。培養皿をインキュベーターから取り出した後、ピペッターまたはパスツールピペットを使用して、カバーガラス皿またはウェルからフィブロネクチン溶液を取り除きます。フィブロネクチンでコーティングされた基質をリンゲルペン連鎖球菌溶液ですすぎた後、適切な量の完全培地を皿またはウェルに加えます。

プラスチックをブロックして組織がくっつくのを防ぐには、P20またはP200ピペッターを使用し、ピペットチップを卵黄リンゲルペン連鎖球菌溶液ですすいでください。次に、孤立した神経ひだをフィブロネクチンでコーティングされたカバーガラスの中心に向かって移し、リンゲルペン連鎖球菌溶液をできるだけ少なく移すように注意します。外植片を10〜15分間沈殿させた後、メッキされた神経ひだのある培養皿をゆっくりと慎重に運び、摂氏38度の加湿チャンバーに入れます。