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トランスジェニック妊娠マウスを取り、蛍光標識運動ニューロンを含む胚で子宮を外科的に切除します。
蛍光顕微鏡下で子宮を氷冷緩衝液の入った皿に移します。
可視光を使用して胚を分離します。
胚の顔と尾を取り除き、腹臥位に向けます。
蛍光シグナルを使用して、中脳を切開し、運動ニューロンを含む動眼核と滑車核を露出させます。
核を含む中脳を分離します。
後脳と脊髄の背側を開きます。脊髄を分離し、両端を切除し、脊髄運動ニューロンを含む柱を収集します。
採取した組織を酵素で処理して、組織マトリックスを解離させます。単一細胞を回収し、FACSを使用して蛍光標識ニューロンを単離します。
単離したニューロンに培地を加え、細胞を培養基質でコーティングされたマイクロプレートに移してインキュベートし、細胞を接着させて増殖させます。
培養中の運動ニューロンを維持します。
受精後約11.5日で妊娠中のマウスからIslet-1 EGF陽性胚を採取することから始めます。腹部にエタノールを徹底的にスプレーし、滅菌顕微解剖はさみと親指包帯鉗子で子宮を取り除きます。滅菌PBSで子宮を短時間洗浄します。次に、事前に冷却された滅菌PBSで満たされた解剖プレートに移します。
顕微鏡の明るい光の下で、顕微解剖はさみ、親指包帯鉗子、デュモンナンバー5ピンセットを使用して、子宮から胚を慎重に取り除きます。次に、滅菌Moriaミニ穴あきスプーンを使用して、各胚を、1X V27を添加した予冷したHibernate E低蛍光培地で満たされた24ウェルプレートの別々のウェルに移します。
プレートを氷の上に置いたまま、1つの胚を滅菌解剖プレートに移し、氷冷の滅菌ハンクバランス塩溶液(HBSS)で完全に覆います。ピンセットを使用して、中脳を損傷することなく胚の顔と尾を取り除きます。次に、手足にまたがり、尾を顕微鏡の正面に向けて胚をうつ伏せに置きます。
ピンセットを使用して第4脳室の屋根を切り裂き、小さな開口部を作ります。この開口部を使用して、第 4 脳室とその屋根の間に作られたスペースにピンセットを引っ掛けます。胚の吻側の背側表面に沿って皮質まで、床板と運動柱の外側
に解剖します。次に、解剖された組織を開いた方法で開いて、GFP陽性のCN3およびCN4核を明らかにします。腹側中脳を胚から慎重に分離し、ピンセットと顕微解剖ナイフで髄膜組織を除去します。
ニューロンに触れたり損傷したりしないように注意しながら、両側のGFP陽性CN3およびCN4核を床板および他のGFP陽性の周囲組織から切り離します。別々のCN3核とCN4核を採取する場合は、これら2つの核の中脳に沿って切断し、P1000ピペットを使用して、最小限のHBSSで解剖された腹側中脳組織を採取します。
解剖培地で満たされたラベル付きの1.7ミリリットル微量遠心チューブに入れます。解離するまでチューブを氷上に保管します。総数が実験要件を満たすまで、同じチューブ内の追加の胚から腹側中脳をプールし続けます。
腹側脊髄を解剖するには、頭を顕微鏡の前面に向けて胚をうつ伏せにします。1組のピンセットでそれを持ち、もう1組の先端を第4脳室の未開の尾部に挿入します。後脳の残りの部分と脊髄を胚の吻尾範囲全体にわたって背側に開きます。鉗子をはさみとして使用して、第4脳室から尾脊髄の中心管に向かって背側組織を切断します。
次に、1セットのピンセットで胚を持ち、もう一方のペアで両側の背側組織のフラップをつまみ取ります。顕微解剖ナイフを使用してGFP陽性SMNの真下に穴を開け、両側をのこぎりのような動きで腹側脊髄を持ち上げて腹側脊髄を除去します。
下肢の上端で脊髄を横方向に切断し、頸椎腰椎部分を切除します。最初のGFP陽性の前角が突き出ているC1の真上で横方向に切断します。腹側脊髄の背側を上にして置き、ピンセットでGFP陽性SMNカラムの間にGFP陰性組織を押して保持します。
GFP陽性SMNカラムの両側を顕微解剖ナイフでトリミングすることにより、残りの付着間葉系、DRG、および背脊髄を除去します。P1000ピペットを使用して、最小限のHBSSで解剖された腹側脊髄組織を収集し、解剖培地で満たされた標識付きの1.7ミリリットル微量遠心チューブに入れます。解離するまで氷上に保管し、同じチューブ内の追加の胚から腹側脊髄をプールし続けます。
解剖した組織サンプルを含む各微量遠心チューブに適切な量のパパイン溶液を加えます。チューブを摂氏37度で30分間インキュベートし、指をフリックして10分ごとにチューブを攪拌します。
インキュベーション後、各懸濁液をP200ピペットで8回穏やかに粉砕します。300回gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを適切な量のアルブミンオボムコイド阻害剤溶液で静かに上下にピペッティングして再懸濁します。遠心分離を繰り返します。次に、P1000ピペットで上清を慎重に取り除きます。細胞を適切な量の解剖培地に再懸濁します。懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過します。
次に、FACSソーティングを使用して、CN3、CN4、およびSMNから解剖されたGFP陽性細胞を分離します。単離された細胞懸濁液を摂氏37度に予熱したモーターニューロン培養培地で適切な密度に希釈し、PDLラミニンでコーティングされた96ウェルプレートのウェルに200マイクロリットルの懸濁液を加えます。摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターでニューロンを培養し、5日ごとに運動ニューロン培地をリフレッシュしてください。