マウス胚からの眼球運動ニューロン、Trochlearニューロン、および脊髄運動ニューロンの分離と培養

トランスジェニック妊娠マウスを取り、蛍光標識運動ニューロンを含む胚で子宮を外科的に切除します。

蛍光顕微鏡下で子宮を氷冷緩衝液の入った皿に移します。

可視光を使用して胚を分離します。

胚の顔と尾を取り除き、腹臥位に向けます。

蛍光シグナルを使用して、中脳を切開し、運動ニューロンを含む動眼核と滑車核を露出させます。

核を含む中脳を分離します。

後脳と脊髄の背側を開きます。脊髄を分離し、両端を切除し、脊髄運動ニューロンを含む柱を収集します。

採取した組織を酵素で処理して、組織マトリックスを解離させます。単一細胞を回収し、FACSを使用して蛍光標識ニューロンを単離します。

単離したニューロンに培地を加え、細胞を培養基質でコーティングされたマイクロプレートに移してインキュベートし、細胞を接着させて増殖させます。

培養中の運動ニューロンを維持します。

受

精後約11.5日で妊娠中のマウスからIslet-1 EGF陽性胚を採取することから始めます。腹部にエタノールを徹底的にスプレーし、滅菌顕微解剖はさみと親指包帯鉗子で子宮を取り除きます。滅菌PBSで子宮を短時間洗浄します。次に、事前に冷却された滅菌PBSで満たされた解剖プレートに移します。

顕微鏡の明るい光の下で、顕微解剖はさみ、親指包帯鉗子、デュモンナンバー5ピンセットを使用して、子宮から胚を慎重に取り除きます。次に、滅菌Moriaミニ穴あきスプーンを使用して、各胚を、1X V27を添加した予冷したHibernate E低蛍光培地で満たされた24ウェルプレートの別々のウェルに移します。

プレートを氷の上に置いたまま、1つの胚を滅菌解剖プレートに移し、氷冷の滅菌ハンクバランス塩溶液(HBSS)で完全に覆います。ピンセットを使用して、中脳を損傷することなく胚の顔と尾を取り除きます。次に、手足にまたがり、尾を顕微鏡の正面に向けて胚をうつ伏せに置きます。

ピンセット

を使用して第4脳室の屋根を切り裂き、小さな開口部を作ります。この開口部を使用して、第 4 脳室とその屋根の間に作られたスペースにピンセットを引っ掛けます。胚の吻側の背側表面に沿って皮質まで、床板と運動柱の外側

に解剖します。

次に、解剖された組織を開いた方法で開いて、GFP陽性のCN3およびCN4核を明らかにします。腹側中脳を胚から慎重に分離し、ピンセットと顕微解剖ナイフで髄膜組織を除去します。

ニューロンに触れたり損傷したりしないように注意しながら、両側のGFP陽性CN3およびCN4核を床板および他のGFP陽性の周囲組織から切り離します。別々のCN3核とCN4核を採取する場合は、これら2つの核の中脳に沿って切断し、P1000ピペットを使用して、最小限のHBSSで解剖された腹側中脳組織を採取します。

解剖培地で満たされたラベル付きの1.7ミリリットル微量遠心チューブに