ヒト神経幹細胞の神経前駆細胞とアストロサイト前駆細胞への分化

細胞培養由来の条件付け培地中のヒト神経幹細胞の3次元集合体である非接着性神経球から始めます。

この培地には、細胞の生存率を維持する栄養素、成長因子、細胞外マトリックス成分が含まれています。

遠心分離機で神経球を収集します。

トリプシンとDNase酵素で処理し、内容物を混合してからインキュベートします。

トリプシンは細胞間の接着を破壊して細胞の剥離を促進し、DNaseは遊離DNAを分解して細胞の凝集を防ぎます。

内容物を繰り返しピペットで移動させて、単一細胞懸濁液を形成します。次に、トリプシン阻害剤を加えて酵素活性を中和します。

上清を遠心分離して除去し、神経成長因子を含む増殖培地に細胞を再懸濁します。

マルチウェルプレートに配置されたポリマーでコーティングされたカバーガラスに細胞懸濁液を播種します。幹細胞がポリマーに付着できるようにインキュベートします。

さらに、特定の成長因子の吸収に基づいて、幹細胞は神経細胞と星状細胞の前駆細胞に分化し、特殊な細胞型にさらに成熟する準備ができています。

テキストプロトコルに従って培地を調製し、ヒト神経幹細胞をプレーティングした後、継代する細胞のフラスコをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネットまたはBSCに持ち込みます。フラスコをゆっくりと傾けて、細胞をプールした培地の底に沈

10ミリリットルの培地を2つの5ミリリットルの部分に、調整された培地用に「CM」とラベル付けされたきれいな15ミリリットルのチューブに移します。フラスコに沈殿した細胞を吸引しないように注意してください。3ミリリットルの培地をCMチューブから「トリプシン阻害剤溶液」とラベル付けされた15ミリリットルのチューブに移します。次に、CMチューブを脇に置きます。

次に、T75フラスコに残っている5ミリリットルの培地と細胞を取り出し、「細胞」とラベル付けされた清潔な15ミリリットルのチューブに入れます。次に、血清ピペットと3.5ミリリットルのCMを使用して、T75フラスコを2回すすぎ、CMリンスを「細胞」チューブに移します。これにより、T75フラスコからすべての神経球が除去されます。

「細胞」チューブを室温で100 g で5分間遠心分離します。細胞が回転している間に、事前に調製したDPBSグルコース溶液を摂氏37度のウォーターバスから得、適量のトリプシンとDNaseを加えます。

細胞」チューブの回転が止まったら、コンディショニングされた培地上清をすべて除去し、CMチューブに移します。15ミリリットルチューブ内の細胞ペレットにトリプシン溶液を加え、5ミリリットルのピペットを使用して約5〜10回上下にピペットします。チューブのキャップを閉じ、摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。

トリプシン阻害剤チューブに、適切な量のトリプシン阻害剤を加え、トリプシン溶液に使用したのと同じ量の溶液を加えます。次に、トリプシン阻害剤溶液を摂氏37度の水浴に必要になるまで入れます。

インキュベーション後、細胞を上下に5〜10回ピペットで移動します。次に、サンプルを摂氏37度のウォーターバスでさらに10〜15分間インキュベートします。細胞インキュベーションに続いて、球体が完全に解離するまで細胞を上下にピペットで移動します。次に、すぐにトリプシン阻害剤溶液を加え、細胞懸濁液を上下に10回ピペットで移動します。

懸濁液中の細胞数を数えるには、15マイクロリットルのトリパンブループレ混合物を小さな計量ボートにピペットで入れ、5マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。上下に3〜5回ピペットで混ぜます。次に、10マイクロリットルのトリパンブルー細胞懸濁液を、ガラスカバーガラスで覆われた血球計算盤の両側に移します。

光学顕微鏡で細胞を観察し、4つの角のグリッドのそれぞれにある細胞の総数を数えます。次に、これらの数値を合計します。テキストプロトコルに従って細胞数を計算した後、各T75フラスコに細胞懸濁液の容量を加えて、フラスコあたり5 x 10⁶細胞を取得します。

容量が5ミリリットル未満の場合は、5ミリリットルまでの調整培地を追加します。次に、成長因子を含む新しいDFHGFPS培地10ミリリットルをフラスコに加えます。フラスコにセルの種類、日付、フラスコ内のセルの数、継代番号が記載されていることを確認してください。必要に応じて、この時点で細胞をインキュベートします。

接着したHNSCをプレートするには、継代の前日に、テキストプロトコルで説明されているようにBSCを洗浄し、鉗子を使用して単一の滅菌12ミリメートルガラスカバーガラスを24ウェルプレートのウェルに入れます。ウェルをカバーガラスで覆い、ウェルあたり250マイクロリットルの0.01%ポリ-D-リジンまたはPDLを滅菌水中でコーティングし、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。ウェルからPDLを取り出し、1平方センチメートルあたり1マイクログラムのラミニンDPBSでコーティングします。

プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日不要な場合は、プレートの端にパラフィルムを巻き付けて密封し、摂氏4度で保管します。吸引によってウェルから余分なラミニン溶液を取り除き、0.5ミリリットルのDPBSを使用してウェルを一度すすぎます。次に、1平方センチメートルあたり0.6〜1 x 10⁵細胞の密度で細胞を各ウェルに播種します。