ヒト人工多能性幹細胞からの前脳型大脳オルガノイドの生成

Rhoキナーゼ阻害剤を添加した幹細胞培地にヒト人工多能性幹細胞またはiPS細胞を含む低付着ウェルプレートから始めます。

阻害剤は細胞に入り、Rhoキナーゼ酵素をブロックし、細胞の生存率を維持します。これにより、iPS細胞凝集体の形成が促進されます。

培地を幹細胞培地に交換して、凝集体を増殖させます。それらを皮質誘導培地を備えた低付着培養皿に移します。

この培地の成分により、iPS細胞は神経前駆体である神経外胚葉細胞に分化します。

各神経外胚葉凝集体を浅いウェルのあるフィルムに移します。

培地を基底膜マトリックスに交換し、インキュベートしてマトリックスの固化と凝集体の閉じ込めを可能にします。

これらのマトリックス包埋凝集体を皮質誘導培地を含む皿に移し、攪拌しながらインキュベートします。

時間が経つにつれて、神経外胚葉細胞は分化因子を利用し、神経上皮細胞に発達します。

培地をオルガノイド分化培地に変更すると、細胞がより特殊な細胞型に成熟し、前脳皮質に似た大脳オルガノイドが形成されます。

多能性幹細胞凝集体を生成するには、幹細胞培養が70%から90%のコンフルエントに達したら、500マイクロリットルの細胞解離試薬を6ウェル培養プレートの1ウェルに加えて細胞を剥離します。

単層培養条件に適応した人工多能性幹細胞は、解離および凝集手順中にストレス誘発性細胞死を起こしにくいため、凝集体を生成するのに適した細胞型です。

摂氏37度で5〜10分後、プレートを軽くたたき、2ミリリットルのDMEM / F-12を使用してウェルの底から細胞を洗浄します。得られた細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、より多くのDMEM / F-12培地で細胞溶液の量を最大10ミリリットルまでします。

カウント後、多能性幹細胞凝集体あたり3番目の細胞に4.5倍10を新しい15ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって細胞を収集します。ペレットを適切な量の多能性幹細胞培地に再懸濁し、50マイクロモルのROCK阻害剤を添加して、培地濃度150マイクロリットルあたり4.5 x 10³細胞を達成します。

次に、150マイクロリットルの細胞を96ウェルの低付着Uボトムプレートの個々のウェルに加え、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。前神経外胚葉誘導をモニタリングするには、組織培養顕微鏡を使用して、低倍率で多能性幹細胞凝集体の形態学的変化を毎日綿密に観察します。

1日目に、境界がはっきりした細胞凝集体を観察する必要があります。2日目に、各ウェルの底にある細胞凝集体を乱すことなく培地の約2/3を慎重に吸引し、廃棄した培地を100マイクロリットルの新鮮な多能性幹細胞培地と交換します。

4〜6日後、細胞凝集体が直径350〜450マイクロメートルに達し、滑らかなエッジを示したら、改変された100マイクロリットルのピペットチップを使用して、最大20個の凝集体を5ミリリットルの皮質誘導培地を含む単一の6センチメートルの低付着培養プレートに移します。

質誘導培地を3日に1回新鮮な培地と交換し、4倍の目的の下で凝集体の形態を毎日監視します。皮質誘導培地で4〜5日後、細胞凝集体の端が表面で明るくなり始め、神経外胚葉の分化を示し、偽成層上皮の放射状組織化が現れるはずです。

神経外胚葉凝集体をマトリックス足場に埋め込むには、基底膜抽出物を氷上に2〜3時間充填します。抽出物が解凍されている間に、滅菌ハサミを使用してプラスチックパラフィンフィルムをオルガノイド16個あたり4×4センチメートル四方に切断し、各フィルムを空の100マイクロリットルのマイクロピペットチップトレイの上に置きます。

手袋をはめた指先でパラフィンフィルムを押して小さなくぼみが現れるようにし、70%エタノールでフィルムを洗浄します。密閉された無菌バイオセーフティキャビネットで30分間UV照射した後、1および1/2〜2ミリメートルの開口部を備えた改良された100マイクロリットルのピペットチップを使用して、各細胞凝集体をフィルム内の1つのディンプルに移します。

すべての凝集体が移されたら、カットされていない100マイクロリットルのピペットチップを使用して、各ディンプルから培地を注意深く吸引し、40マイクロリットルの原液基底膜抽出物を各細胞凝集体に加えます。

暴な操作やピペットチップへの吸引によってオルガノイドが損傷しないように注意してください。

ピペットチップを使用して凝集体を各液滴の中央に配置し、滅菌鉗子を使用してプラスチックパラフィンフィルムシートを10センチメートルのペトリ皿に慎重に移します。皿をインキュベーターに15〜20分間入れます。

抽出物が固化している間に、5ミリリットルの新鮮な皮質誘導培地を1つの6センチメートルの低付着培養皿に加えます。インキュベーションの最後に、パラフィンフィルムシートを裏返し、滅菌鉗子を使用して、最大16個の重合液滴を各6センチメートルの皿にそっと絞ります。次に、凝集体を細胞培養インキュベーターに戻します。

翌日、オルガノイド培養皿を、凝集体が目的の分化段階に達するまで毎日光学顕微鏡モニタリングを行いながら、細胞培養インキュベーター内で14RPMで5度の角度に傾けたロッキング細胞培養シェーカーに移します。