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神経堤細胞(NCC)の子孫である蛍光タンパク質発現脂肪由来幹細胞を含む収穫されたトランスジェニックマウス大動脈周囲脂肪組織を取ります。
消化培地を加え、組織をみじん切りにします。
消化培地を含むみじん切り組織をチューブに移します。フラグメントを機械的に解離します。
インキュベート。培地中のコラゲナーゼは組織の細胞外マトリックスを消化し、幹細胞、脂肪細胞、線維芽細胞を放出します。
血清含有培地を追加して、コラゲナーゼ活性を停止します。脂肪細胞を含む上清を遠心分離して廃棄します。
細胞を培地に再懸濁し、ろ過して凝集体を除去します。
濾液を遠心分離し、上清を除去します。赤血球溶解バッファーに細胞を再懸濁して赤血球を溶解します。
溶解を止めるために血清含有バッファーを加えます。遠心分離して上清を廃棄します。
細胞をバッファーに再懸濁します。
蛍光活性化細胞選別を実行して、蛍光幹細胞を単離します。
単離された幹細胞は、さらなる実験に使用できます。
採取した脂肪組織を、調製したばかりの消化培地1ミリリットルを含む新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、手術用ハサミを使用して組織をみじん切りにします。組織スラリーを9ミリリットルの新鮮な消化培地を含む50ミリリットルのチューブに移し、1ミリリットルのピペットを使用して組織を10回粉砕します。
均一な溶液が得られたら、チューブを摂氏37度、毎分100回転で30〜45分間インキュベートし、過剰消化を防ぐために5〜10分ごとにチェックします。チューブを穏やかに渦巻くと淡黄色の均質な脂肪組織溶液が観察されたら、10%ウシ胎児血清を添加した5ミリリットルのHDMEMで消化を停止します。完全に混合した後、脂肪組織サンプルを遠心分離します。
間質血管細胞画分は茶色がかったペレットとして見えます。ペレットを10ミリリットルの培地に再懸濁し、70マイクロメートルの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。
別の遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを5ミリリットルの赤血球溶解バッファーに穏やかに再懸濁します。サスペンションを15ミリメートルのチューブに移します。10分後、1%ウシ胎児血清を添加した10ミリリットルのPBSを2回遠心分離して反応を停止します。
2回目の遠心分離後、ペレットを氷上の5ミリリットルの培地に再懸濁し、最終遠心分離で細胞を回収します。次に、細胞を5ミリリットルのFACSバッファーに再懸濁して計数します。
標準プロトコルに従ってFACSによる単離後にNCADSC培養物を設定するには、細胞を各ウェルに5 x 103細胞/cm2濃度で、12ウェル培養プレートを完全培地に摂氏37度、および5%二酸化炭素で20〜24時間配置します。翌日、細胞を摂氏37度のPBSで洗浄し、培養物に新鮮な培地を与えます。