マウスの粘膜下層および固有層からの腸管グリア細胞の単離

縦筋と筋神経叢、腸ニューロンを含む層、およびグリア細胞を以前に剥がしたマウスの小腸セグメントを取ります。

組織を切断し、EDTAを含む緩衝液に入れます。ロッキングでインキュベートします。

EDTAは細胞間接合部を破壊し、上皮粘膜を下にある固有層および粘膜下層(腸グリア細胞を含む結合組織層)から剥離します。

ペットを繰り返して上皮細胞を取り除きます。

セルストレーナーでろ過し、フロースルーを廃棄します。

組織を非酵素解離バッファーに移し、ロッキングでインキュベートします。解離バッファーは固有層と粘膜下細胞外マトリックスを緩め、細胞を剥離します。

細胞をさらに解離するために繰り返しピペットを踏みます。

細胞ストレーナーでろ過して細胞を収集します。

細胞を遠心分離し、バッファーに再懸濁します。

グリア増殖培地を含む接着タンパク質でコーティングされたウェルを取り、細胞をプレートします。

コーティングは細胞接着を促進し、成長因子はグリア細胞の増殖を選択的に促進し、固有層と粘膜下グリア細胞培養を確立します。

上皮粘膜を除去するには、まず細いハサミを使用して腸を約0.5センチメートルに切り、30ミリリットルの氷冷EDTA/HEPES/DPBS溶液に集めます。組織含有溶液を摂氏4度で10分間、毎分約60傾けて揺らします。

EDTA/HEPES/DPBSバッファーを上下に1回ピペッティングして5ミリリットルのプラスチックピペットを事前に湿らせ、次に、事前に湿らせたピペットを使用して組織を粉砕し、懸濁液を20回減らして上皮粘膜を取り除きます。

混合物を100ミクロンのナイロン細胞ストレーナーに注いで組織を回収し、ニードルノース鉗子を使用して、ストレーナーに保持された組織を30ミリリットルの氷冷EDTA / HEPES / DPBSを含む新しい50ミリリットルの円錐形遠心分離管に入れます。組織を摂氏4度で10分間、毎分約60傾けて揺らし、追加の上皮粘膜を剥がすことにより、EDTA/HEPES/DPBSインキュベーションを2回繰り返します。

事前に湿らせた5ミリリットルのピペットを使用して穏やかな粉砕を行います。組織は、より多くの上皮が除去されるにつれて、ピペットの内側にくっつく傾向があります。

腸内グリア細胞はより壊れやすいため、この時点では穏やかな粉砕が必要です。

2回目のインキュベーション後に、混合物を100ミクロンのナイロンセルストレーナーに注ぎ、流れを廃棄して組織を収集します。2 番目のフロースルーは、最初のフロースルーよりも濁りが著しく少ないはずです。溶液がほぼ透明になるまで、10分間のEDTAインキュベーションを繰り返します。

ナイロンストレーナーから、5ミリリットルの市販の細胞回収液を含む15ミリリットルの円錐形遠心分離管に組織を移します。その後、摂氏4度で25〜30分間揺らします。10回穏やかに粉砕して腸内グリア細胞を固有層から解離させ、次に40ミクロンのフィルターでろ過し、濾液をきれいな50ミリリットルのチューブに集めます。

ナイロンフィルターのティッシュを1ミリリットルのDPBSですすいでください。組織を廃棄し、5〜6ミリリットルの濾液を清潔な15ミリリットルの円錐形遠心分離管に移します。濾液をスイングバケツ遠心分離機で摂氏4度で5分間、2,000 g で回転させます。

グリア細胞含有ペレットを少なくとも1ミリリットルの再懸濁バッファーに再懸濁し、気泡を発生させずに500マイクロリットルのピペットチップでペレットを上下に穏やかにピペッティングします。最後に、ラミニンでコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を添加するか、グリア増殖培地を含む12ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを加えて、腸内グリア細胞をプレートします。