0 閲覧数 • 3:45 分 • July 8th, 2025
ブタの脳を取ります。
髄膜細胞の汚染を防ぐために、脳を覆う保護膜である髄膜を取り除きます。
毛細血管が豊富な領域である灰白質をこすり落とし、培地を含む培養皿に組織を収集します。
灰白質を針なしで注射器に通し、組織を断片化します。
断片をホモジナイザーに移し、均質化して組織をさらに崩壊させ、脳毛細血管を放出します。
ホモジネートを特定の孔径のフィルターに通して毛細血管を保持し、他の脳細胞が通過できるようにします。
酵素とDNaseを含む溶液にフィルターを入れます。
酵素は接着細胞を剥離し、DNase は汚染された DNA を分解し、純粋な毛細血管の単離を促進します。
フィルターから毛細管を洗います。
血清タンパク質を含む培地を加えて酵素を不活性化します。
毛細血管をチューブに移し、遠心分離し、上清を除去します。さらなる分析のために、純粋な毛細血管を新鮮な培地に再懸濁します。
この手順を開始するには、脳を滅菌フローベンチに入れ、氷の上に置いたビーカーで1リットルのPBSで優しく洗浄します。次に、先端の細い鉗子を使用して各脳から髄膜を慎重に取り除きます。メスを使用して、脳から灰白質を一度に1つずつこすり落とし、分離された物質を氷上に置いた20ミリリットルのDMEM / F12を含むペトリ皿に移します。
最初の断片化のために、針なしで灰白質材料を50ミリリットルの注射器に通します。すべての脳に対してこの手順を繰り返し、収集した灰白質物質をプールします。DMEM/F12培地で単離された灰白質材料をハンドヘルド組織ホモジナイザーのグラインダーチューブに移します。緩い乳棒で上下に8回ストロークし、続いてタイトな乳棒で上下に8ストロークして材料を均質化します。
次に、フィルターホルダーと140ミクロンのフィルターメッシュを備えた500ミリリットルの青いキャップボトルを使用してホモジネートをろ過することにより、毛細血管を分離します。フィルターを含むキャピラリーを消化液と一緒にペトリ皿に入れます。その後、ペトリ皿を摂氏37度でオービタルシェーカーで180RPMで1時間インキュベートするか、10分ごとに穏やかにかき混ぜます。
1時間後、ペトリ皿からの懸濁液でフィルターから毛細管を洗い流します。次に、3つの皿からの懸濁液を2つの50ミリリットルチューブに分割し、各50ミリリットルチューブに10ミリリットルのDMEM / F12を加えて消化を停止します。
細胞懸濁液を250倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、各ペレットを10ミリリットルのDMEM / F12に再懸濁します。次に、さらに20ミリリットルのDMEM / F12を各チューブに加えます。
本記事では、in vitro 血液脳関門(BBB)モデルを構築するために、新鮮な豚脳から毛細血管を単離する改良プロトコルを紹介します。本手法では、さらなる分析や細胞培養への適用に適した純粋な脳毛細血管を得るために、髄膜の慎重な除去、精密な組織操作、および酵素消化に重点を置いています。
豚脳毛細血管の信頼性の高い単離は、中枢神経系(CNS)創薬における極めて重要な転換点となる、堅牢なin vitro血液脳関門(BBB)モデルの開発を支えるものです。高純度の毛細血管標本を用いることで、開発パイプラインの早期段階において、化合物の透過性の予測的評価およびメカニズムに基づいたリスク軽減が可能になります。この機能は、神経治療プログラムにおけるトランスレーショナルな連続性とポートフォリオの選別を支援します。
このキャピラリー分離プロトコルは、初期探索とアッセイ開発のインターフェースに位置しており、下流のBBBモデリングおよび化合物スクリーニングのワークフローを可能にします。
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最終更新:29 8月 2026