ラット脳からの神経血管ユニットの分離法

脳の最外層であるラットの皮質脳組織を含む冷たいガラス乳鉢から始めます。

プロテアーゼ阻害剤を含む脳微小血管緩衝液またはBMBを追加します。

次に、乳棒を上下に動かして組織を解離させます。

この撹拌により、微小血管、周皮細胞、ニューロン、グリア細胞からなる神経血管単位 (NVU) が放出されます。プロテアーゼ阻害剤は、放出されたプロテアーゼをブロックし、微小血管を保護します。

この混合物をチューブに移します。

高密度多糖類溶液を加えます。渦を使用して、溶液を他の内容物と均一に混合します。

遠心機。高密度の多糖類は、組織破片よりも密度の高いNVUの沈降を可能にします。

上清を廃棄し、プロテアーゼ阻害剤と多糖類溶液を含むBMBにNVUを再懸濁します。

渦を使って内容物を混ぜます。

遠心分離プロセスを繰り返します。上清を廃棄して、残留破片を取り除きます。

NVUをBMBに再懸濁し、さらなる分析のために保存します。

皮質脳組織を冷やしたガラス乳鉢に入れます。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む5ミリリットルのBMBを加えます。オーバーヘッドパワーホモジナイザーを使用して、乳棒を乳鉢に挿入し、3,700 RPMで15回の上下ストロークを使用して脳組織を均質化します。次に、ホモジネートを標識された遠心分離管に注ぎます。サンプルの間に、70%エタノールを使用して乳棒を洗浄します。

遠心分離を実行するには、脳ホモジネートを含む各標識遠心分離管に8.0ミリリットルの26%デキストラン溶液を加えます。チューブを2回反転させてから、サンプルを完全にボルテックスします。複数の角度を使用して各サンプルの渦を行い、脳ホモジネート溶液と 26% デキストラン溶液を完全に混合させます。サンプルを5,000 g、摂氏4度で15分間遠心分離します。

上清を吸引し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む5.0ミリリットルのBMBにペレットを再懸濁します。次に、ペレットをボルテックスして完全に混合します。次に、先ほど示したように、各遠心分離管に8.0ミリリットルの26%デキストランを加え、ボルテックスします。次に、サンプルを再度遠心分離します。

真空フラスコとガラスピペットを使用して、上清を吸引し、脳微小血管を含むペレットが破壊されないようにします。ペレットをプロテアーゼ阻害剤でBMBに再懸濁し、次に26%デキストランをさらに2回再懸濁します。最終遠心分離後、各ペレットに 5.0 ミリリットルの BMB を加え、ボルテックスしてサンプルを再懸濁します。