神経細胞培養のための背根神経節の採取と解離の技術

ラットの脊柱の一部を取り、それを分割して脊髄を取り除きます。

テライトグリア細胞(SGC)に囲まれたニューロンのクラスターである後根神経節(DRG)を切り離します。

DRGを成長培地に入れます。SGC汚染を減らすために神経根を取り除きます。

コラゲナーゼで処理して組織マトリックスを分解し、洗浄して酵素を除去します。

トリプシンを導入して細胞間接続を破壊します。トリプシンを不活性化するタンパク質を含む血清を追加します。

増殖培地を加え、組織を機械的に解離します。懸濁液をろ過して単一細胞を分離し、遠心分離して組織の破片を除去します。

細胞を再懸濁して密度勾配培地に層状に層状にし、遠心分離します。

密度の高いニューロンは底に沈殿し、SGCの分離を容易

ニューロンを培地に再懸濁します。それらを培養基質にコーティングしたウェルに移し、細胞の付着を可能にします。

神経細胞の生存のための神経成長因子の補充

脊髄を採取した後にDRGニューロンを取得するには、まず背側部分を取り除き、次に滅菌および鋭利な手術用ハサミを使用して脊柱を縦軸に沿って半分に分割し、臍帯組織を露出させます。脊柱を胸郭の高さより下の2つの小さなセグメントに切断し、次に細い鉗子を使用してすべての臍帯組織をそっと取り除き、管から直接出てくる白いフィラメントとして現れるDRG根を引っ張って取り除かないように注意します。

コア組織をすべて除去したら、非常に細い鉗子を使用してDRG根全体を引っ張り、椎管の奥深くまで伸び、神経節の根を損傷しないように注意します。DRGを、抗生物質を添加した3〜4ミリリットルのハムのF-12培地を含む60平方ミリメートルのペトリ皿に入れます。次に、解剖顕微鏡下で、滅菌鉗子とメスを使用して神経節を取り巻く余分な神経根を取り除き、衛星細胞の汚染を軽減します。

次に、DRGを1.8ミリリットルの新鮮なF-12培地を含む35平方ミリメートルのペトリ皿に移し、200マイクロリットルのコラゲナーゼ4型ストック溶液を加えます。DRGを1時間インキュベートしてから、DRGを吸引したり損傷したりしないように注意しながら、ガラスピペットで培地を慎重に吸引します。

コラゲナーゼステップを繰り返し、DRGをF-12培地で洗浄します。2回目の洗浄後、1.8ミリリットルのF12培地と200マイクロリットルのトリプシンを細胞に加え、トリプシンを除去し、500マイクロリットルのFBSを添加した1ミリリットルの培地を加えて酵素反応を阻止します。次に、培地を吸引し、DRGをF-12培地で3回穏やかに洗浄して、血清の痕跡をすべて除去します。

次に、細胞に2ミリリットルの新鮮なF-12培地を供給し、ガラスピペットを使用して細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに慎重に移します。上下に8〜10回ピペットでニューロンを穏やかに解離させ、ペレットをチューブの底に蓄積させます。ペレットが沈殿したら、上清を新しいチューブに移し、2ミリリットルの新鮮なF12培地をペレットに加え、懸濁液が均一になるまで機械的解離と培地移送を繰り返します。

次に、細胞懸濁液を3〜4回粉砕し、続いて、得られた均質化された懸濁液を100ミクロンの細胞ストレーナーを通して新しい50ミリリットルチューブにろ過します。15ミリリットルのチューブで細胞を遠心分離します。回転させている間に、調製したばかりの15%ウシ血清アルブミンを45度の角度で保持した15ミリリットルのチューブの内側にゆっくりとピペットで入れ、チューブ上の数字を成形トラックの基準として使用して、徐々にタンパク質の軌跡を作成します。

次に、細胞から上清を吸引し、ペレットを再懸濁するために最後の500マイクロリットルを節約し、タンパク質の軌跡に沿って細胞を新しいチューブにゆっくりと分注します。細胞を再びスピンダウンした後、ペレットを1ミリリットルの修飾BS培地に再懸濁し、24ウェルプレート内の少量の培地に細胞を2時間播種します。細胞が付着したら、神経成長因子1ミリリットルあたり50ナノグラムを添加した新鮮なBS培地を追加します。