マウス脳周皮細胞の単離と培養

マウスの脳組織に緩衝液を加え、均質化して細胞と微小血管を放出します。

次に、BSA-デキストラン溶液をホモジネートに加えます。混合して遠心分離して成分を分離します。上清を捨てます。

微小血管をバッファーに再懸濁し、フィルターに通して大きな血管を除去します。

次に、濾液を遠心分離し、上清を除去します。微小血管をDNAを含むバッファーに再懸濁します。

タンパク質分解酵素を添加して、内皮細胞と周皮細胞を放出します。

DNaseはDNAを分解します。

BSAを含むバッファーを添加して、酵素活性を停止します。遠心分離して上清を廃棄します。

細胞を培地に再懸濁し、基底マトリックスでコーティングされたマルチウェルプレートにプレートします。インキュベートし、細胞接着を促進します。

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内皮細胞は単層を形成し、周皮細胞の成長をサポートします。

ゼラチンでコーティングされたマルチウェルプレート上の周皮細胞培地でのその後の細胞継代は、内皮細胞を排除しながら周皮細胞の増殖を促進します。

まず、特定の病原体のない4〜6週間齢の雄C57ブラック6マウスの脳を無菌で乾燥した糸くずの出ないワイプの上に置き、湾曲した先端鉗子を使用して小脳、線条体、および後頭神経を除去します。綿棒を使用して目に見える髄膜をすべて取り除き、脳組織を逆さまにします。葉を外側に軽くストロークして開き、目に見える血管をすべて取り除きます。次に、髄膜のない脳組織を、15ミリリットルの冷洗浄バッファーBを含む100ミリメートルのペトリ皿に入れます。

組織を均質化するには、脳サンプルをDounce Tissue Grinderモルタルチューブに移し、3〜4ミリリットルの洗浄バッファーBをチューブに加えます。ゆるい乳棒を使用して、組織を55回みじん切りにします。次に、乳棒を洗浄バッファーBですすぎ、組織スラリーをタイトな乳棒で25回みじん切りにします。均質化の最後に、2本の50ミリリットルチューブの間にスラリーを均等に分注し、1.5倍の量の冷たい30%ウシ血清アルブミンデキストランを加えます。次に、チューブを激しく振ってスラリーを混合します。

血管画分を単離するには、遠心分離によって細胞を沈殿させ、上清を2つの新しいチューブに移します。ペレットを氷上の洗浄バッファーBに保管します。ペレットを氷上の3ミリリットルの冷洗浄バッファーBに再懸濁します。

採取した上清を遠心分離し、このステップをもう一度繰り返します。上清を廃棄し、ペレットを3ミリリットルの洗浄バッファーBに再懸濁します。次に、再懸濁したペレットをプールし、プールした細胞懸濁液の最終容量を新鮮な冷洗浄バッファーBで10ミリリットルにします。

さらに、ペレットの塊が残らなくなるまで10mmピペットで細胞を6回解離し、真空フィルターアセンブリとナイロンメッシュストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過します。ストレーナーをペトリ皿に入れ、新鮮な洗浄バッファーBでメッシュを取り除き、毛細血管を回収します。次に、新しいフィルターで2回目のろ過を行います。

濾液を2本のチューブに均等に分割し、遠心分離によって細胞を回収します。上清を廃棄した後、酵素を含む予熱された洗浄バッファーBを含む単一のチューブにペレットをプールし、予熱したコラゲナーゼ分散酵素をチューブに加えます。チューブを摂氏37度で正確に33分間振とうテーブルウォーターバスに入れてから、30ミリリットルの冷洗浄バッファーBで反応を停止します。

遠心分離によって細胞を収集し、上清を慎重に廃棄します。ペレットを洗浄バッファーBにすばやく慎重に再懸濁し、懸濁液を再度遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットをミリリットルの完全DMEM培地に再懸濁し、2ミリリットルの細胞懸濁液を3つのマトリゲルでコーティングされた6ウェルプレートの9ウェルに完全DMEMに播種します。

細胞培養物を摂氏37度、5%二酸化炭素の滅菌インキュベーターに24時間置いてから、各ウェルから破片を慎重に取り除き、新鮮なDMEM培地を加えます。48時間後、48時間ごとに各ウェルの培地を交換します。8〜10日目に、細胞が100%コンフルエントに達したら、寄生虫培養培地中の細胞を新しいゼラチンでコーティングされた6ウェルプレートに継代し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、モニタリングしながらさらに6〜7日間