$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
灌流した成体マウス海馬の断片を、パパインとDNaseを含む解離チューブに入れます。
チューブを機械式解離器の上に置きます。
解離剤は組織を機械的に崩壊させ、ニューロンやグリア細胞などの細胞を緩めます。
パパインは組織の細胞外マトリックスを分解し、細胞を放出します。DNaseは汚染DNAを分解します。
BSAを含むバッファーを加え、酵素を不活性化します。
懸濁液をストレーナーに通して、大きな破片を取り除きます。
濾液を遠心分離します。酵素が豊富な上清を廃棄します。
細胞をバッファーに再懸濁し、新しいチューブに移します。
密度勾配培地を加え、混合し、混合物をバッファーで重ねます。
遠心分離中、細胞と破片は密度に基づいて別々の層を形成します。
最上部のバッファ層と中央の破片層を削除します。
細胞を含む最下層にバッファーを加えて混合します。密度勾配媒体を含む上清を遠心分離して廃棄します。
海馬細胞をバッファーに再懸濁して、さらに分析します。
鉗子を使用して、海馬組織片をCチューブに移し、30マイクロリットルの酵素ミックス2をチューブに加えます。キャップをひねってカチッと音がするまで締めた後、チューブを解離器に入れ、適切なプログラムを実行します。プログラムの実行中に、50ミリリットルの円錐形チューブ上に置かれた70ミクロンのセルストレーナーを2ミリリットルのBSAバッファーで予湿します。
解離プログラムが完了したら、解離した組織に4ミリリットルのBSAバッファーを加え、50ミリリットルのコニカルチューブのセルストレーナーを通して混合物をろ過します。次に、10ミリリットルのDPBSをCチューブに加えます。次に、チューブを閉じ、溶液を穏やかに回転させ、50ミリリットルの円錐形チューブのセルストレーナーを通してろ過します。ろ過した細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を廃棄し、ペレットを保管します。
破片を除去するには、ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいDPBSで再懸濁し、懸濁液をラベル付きの15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、450マイクロリットルの冷たい破片除去液を加え、上下にピペットで移動します。細胞懸濁液に1ミリリットルの冷たいDPBSをそっと重ね、先端を円錐形のチューブの壁に当てます。合計オーバーレイが2ミリリットルになるまで手順を繰り返します。
次に、懸濁液を3,000倍gで10分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキをかけます。最上層を吸引します。次に、ピペットチップを前後にスイープして、白い中間層を吸引します。最下層を乱さずに、中間層をできるだけ取り除きます。次に、2ミリリットルの冷たいDPBSを加え、ピペットを上下に混ぜます。次に、懸濁液を1,000回gで10分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキをかけます。遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを1ミリリットルのBSAバッファーに再懸濁します。