横方向のソフトライト照明を用いた脳オルガノイド培養の最適化技術

白

いパッドと片方の端に取り付けられた白色 LED ライトを備えたアクリル板を含む横方向のソフト ライト照明セットアップを取ります。

胚様体形成培地を含む低接着性マルチウェルプレートを前に配置します。

胚様体、またはEBをプレートに追加します。

アクリル板の側面からLEDライトが入り、平行ビームを放射し、EBを横方向に照らし、肉眼での可視化を可能にします。

プレートを回転させて渦巻き流を誘導し、EBを中心に収束させます。

使用済み培地を新鮮なEB形成培地と交換します。

ワイドボアピペットチップを使用してEBを収集します。

ピペットを直立させて、EBが重力によって沈降できるようにします。

EBを神経誘導培地を含む別の低接着プレートに移します。

先端を媒体に接触させます。EBは液体の表面張力により沈みます。

培地中の特定の因子は、EBの神経分化を開始し、神経上皮層を形成します。

A5用紙サイズの厚さ0.3〜0.5センチの透明アクリル板を使用し、アクリル板の表と裏に白いパッドを貼り付けます。次に、プレートの端にLED白色ライトを一列に設置し、アクリル板の側面から光が入り、平行に発射できるようにします。

次に、新しい6ウェル低接着プレートを準備し、各ウェルに2ミリリットルのEB形成培地を追加します。1000マイクロリットルのワイドボアピペットチップを使用して、EBを培地と一緒に除去した後、ウェルあたり約100EBを6ウェル低接着プレートに移します。

EB形成培地を毎日同じ量の新鮮な培地に交換するには、円形の軌道に沿って皿を回転させることによって渦流を誘導します。EBまたはオルガノイドは、回転によって生成される二次流により、ウェルの中心に収束します。ウェルの端までゆっくりとピペッティングして、古い培地を吸引します。強く吸いすぎないと、EBが一緒に取り除かれます。次に、新しい培地を追加してEBを再懸濁します。

神経誘導の場合は、ウェルあたり3ミリリットルの神経誘導培地を含む新しい6ウェル低接着プレートを準備します。横方向のソフトライトをオンにし、他の屋内光源をオフにします。次に、広口ピペットチップを使用してEBと培地の両方を吸引することにより、神経誘導培地を追加した6ウェルプレートにEBを移します。次に、ピペットを直立させます。EBは重力によって徐々に沈み、ピペットチップの口に向かって収束します。

ピペットチップの口が再び液体表面に接触すると、液体表面張力により、EBは急速に媒体に沈みます。サンプルを摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。