JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:45 分 • July 8th, 2025
神経根を取り、細かく刻
みます。消化酵素含有チューブに移し、インキュベートします。
酵素は細胞外マトリックスを消化します。
消化を止めるために血清を含む培地を追加します。
内容物を繰り返しピペットで移動させ、遠心分離して上清を廃棄します。
ペレットを再懸濁します。
懸濁液をストレーナーに通して、未消化の組織を除去します。収集した細胞をプレート内でインキュベートします。
線維芽細胞とシュワン細胞またはSCがプレートに付着して分裂します。
取り付けられていないセルを取り外します。付着した細胞をリン酸緩衝液で洗浄します。
消化酵素を添加して、消化感受性SCを緩めます。培地で消化を中止します。
メディアを追加して SC を完全に切り離します。
細胞をチューブに移し、遠心分離します。上清を廃棄し、細胞をSC特異的培地に再懸濁します。
細胞をコーティングされていないプレートに移し、インキュベートします。
残っている線維芽細胞は付着し、SCは懸濁状態のままになります。
懸濁液をマトリックスコーティングプレートに移します。
シュワン細胞の付着と分裂のためにインキュベートします。
神経をはさみで3〜5ミリメートルにスライスします。1ミリリットルの0.25%トリプシンを加え、神経片を5ミリリットルの遠心分離管に移します。摂氏37度で18〜20分間インキュベートします。次に、消化を止めるために、10%ウシ胎児血清を含むDMEMを3〜4ミリリットル加えます。混合物を約10回ゆっくりと上下にピペットでピペットで移動します。800倍gで5分間遠心分離します。
遠心分離後、上清を廃棄し、10%FBSを添加した2〜3ミリリットルのDMEMに沈殿物を再懸濁します。細胞懸濁液を400メッシュフィルターでろ過し、懸濁液を使用して60ミリメートルのペトリ皿を接種します。ペトリ皿を5%の二酸化炭素の存在下で摂氏37度で4〜5日間インキュベートします。
培養物が90%コンフルエンスに達したら、1X PBSを使用して細胞を一度洗浄します。次に、シュワン細胞を消化するために、60ミリメートルの皿あたり摂氏37度で1ミリリットルの0.25%トリプシンを加えます。室温で8〜10秒後、10%FBSを添加した3ミリリットルのDMEMを加えて消化を停止します。シュワン細胞を剥がすには、ピペットで細胞をそっと吹きかけます。
細胞が剥がれていることを顕微鏡で確認します。次に、シュワン細胞を含む培地を回収し、800 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、沈殿物を3ミリリットルの培地に再懸濁します。懸濁液を使用して、コード化されていない60ミリメートルのペトリ皿に接種し、皿を摂氏37度で30〜45分間インキュベートします。シュワン細胞を含む培地をポリ-L-リジンでコーティングされた培地ディッシュに移し、ディッシュを摂氏37度で2日間インキュベートします。