初期の椎間板疾患をシミュレートするための炎症誘発性臓器培養モデルの生成

牛の尻尾を取ります。

上にある組織と椎骨突起を取り除き、横方向に切断してセグメントを取得します。

成長板と椎骨終板の間にある椎間板またはIVDを特定します。

IVDの両側を切断し、組織の生存率を維持するために緩衝液に浸したガーゼを入れた皿に入れます。

付着した椎骨組織をこすり落とし、IVDの高さを測定します。

バッファーで洗浄して血液の残留物を取り除き、抗生物質を含むバッファーでIVDを消毒します。

IVDを培地を含むバイオリアクターチャンバーに入れます。

生理学的グループの培地は高グルコースを持っていますが、病理学的グループでは、低グルコース培地は栄養欠乏を誘発します。

チャンバーをバイオリアクターに入れます。

生理学的体外診断の場合は、毎日穏やかな負荷をかけます。病理学的IVDの場合は、毎日より高い速度で激しい負荷をかけます。

毎日の負荷テストの間に、IVDが培地で回復するのを待ちます。

すべての装填手順の後、IVDの高さを測定します。

病理学的 IVD の高さの低下は、変性および炎症誘発性の状態を示しています。

牛

の尻尾全体を水道水でよくすすぎ、表面の汚れや毛を取り除くことから始めます。次に、尾を1%ベタジン溶液に10分間浸して表面を消毒します。メス番号 20 を使用して尾椎から軟部組織を除去し、椎間板または IVD の識別を容易

にします。 骨

除去ペンチで椎骨の棘突起と横突起を取り除きます。各椎体の中央を骨ペンチで横方向に切断して個々の運動セグメントを取得し、収集した運動セグメントをリンゲル液で濡らしたガーゼでペトリ皿に入れます。

モーションセグメントをゆっくりと動かして、IVDと椎骨の位置を確認します。次に、骨の終板の凸面に触れて見つけることで、成長板の位置を特定します。バンドソーの刃をリンゲル液で冷却し、それを使用してIVDの成長プレートに両側に1つずつ2つの平行な切り込みを行います。

IVDをリンゲル液で濡らした清潔なガーゼで清潔なペトリ皿に移します。メスの刃を使って椎体と成長板をこすり落とし、終板はそのままにして。ローディング手順のために2つの表面を平らかつ平行に配置し、削り取ったIVDをリンゲル液で濡らしたガーゼで新鮮なペトリ皿に移します。

キャリパーでディスクの高さと直径を測定します。次に、ジェット洗浄システムを使用してリンゲル液で椎骨の血栓を洗浄します。PBSと10%ペニシリン-ストレプトマイシンでIVDを15分間振とうしながら消毒します。高濃度抗生物質をPBSと1%ペニシリンストレプトマイシンで洗い流します。

ディスクを5ミリリットルのIVD培地を含むIVDチャンバーに移し、湿度85%、二酸化炭素5%の摂氏37度のインキュベーターを備えたバイオリアクターシステムに入れます。実験グループに応じて異なる負荷条件を維持して、バイオリアクターシステム内でディスクを4日間培養します。

生理学的対照群では、0.02〜0.2メガパスカルおよび0.2ヘルツの負荷プロトコルを使用して、1日2時間、高グルコース培地でIVDを培養します。病理学的グループでは、0.32〜0.5メガパスカルおよび5ヘルツの負荷プロトコルを使用して、1日2時間、低グルコース培地でIVDを培養します。

ローディング手順の合間に、IVDを7ミリリットルのIVD培地を入れた6ウェルプレートに入れ、自由な膨潤を回復させます。自由膨潤期間の後、実験期間中の動的負荷の後、キャリパーを使用して毎日椎間板の高さを測定します。