マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

分化培地を含む低付着皿にマウス胚性幹細胞を播種します。

細胞の凝集と神経細胞系統への分化を促進するために、回転下でインキュベートします。

骨材をチューブに移し、重力によって沈降させます。メディアを廃棄します。

凝集体を再懸濁し、レチノイン酸を添加した分化培地を含む元の皿に移します。

レチノイン酸は神経遺伝子の発現を誘導し、神経前駆細胞への分化を引き起こします。

骨材をチューブに移します。培地を取り除き、トリプシンを加えて凝集体を解離させます。

トリプシンを中和するために阻害剤を追加します。

ピ

ペットを繰り返して、均一な細胞懸濁液を得る。懸濁液をろ過して凝集体を除去します。

遠

心分離して上清を除去します。細胞を培地に再懸濁します。

細胞の接着を促進するために、ポリマーでコーティングされた皿に細胞を播種します。

メディアを取り出します。成長因子を含む新しい培地を追加して、ニューロンの成熟を促進し、ネットワーク化されたニューロン集団を形成します。

ESCのニューロンへの分化は、日常的な細胞継代中に始まります。以前と同様にESCを解離しますが、ニューロン分化のための追加のプレートを含めます。350マイクロリットルの細胞懸濁液を、25ミリリットルの分化培地を含む10センチメートルの低付着皿に移します。

摂

氏37度、二酸化炭素5%の組織培養インキュベーター内で30〜45 RPMに設定されたオービタルシェーカーに皿を置き、48時間インキュベートします。48時間後、25ミリリットルのピペットを使用して、分化した細胞凝集体を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。

その

直後に、25ミリリットルの新鮮な分化培地をペトリ皿に加えます。骨材を2〜5分間沈殿させ、深さ1〜2ミリメートルの目に見えるペレットを生成します。まだ懸濁している単一細胞または小さな凝集体を無視して培地を慎重に吸引し、P1000ピペットを使用して細胞ペレットをペトリ皿に戻します。皿をインキュベーターのロータリーシェーカーに戻します。さらに 48 時間後、メディア交換手順を繰り返します。今回は、6マイクロモルのオールトランスレチノイン酸を添加した30ミリリットルの分化培地を加えます。

形成されたペレットの深さは2〜4ミリメートルになります。以前と同様に細胞をインキュベートした後、最後にレチノイン酸の補給で培地交換手順を繰り返します。この時点で、ペレットの深さは4〜8ミリメートルになります。

翌日、プロトコルの書面部分に概説されているように、プレーティング表面を準備します。プレーティング当日の午後、事前に分注されたNPCトリプシン化培地と0.1%大豆トリプシン阻害剤をそれぞれ5ミリリットルを摂氏37度で解凍します。次に、25ミリリットルのピペットを使用して、分化凝集体を培養プレートから50ミリリットルの円錐形チュ