マウス坐骨神経からのシュワン細胞の磁気分離

酵素的に消化されたマウス坐骨神経線維から細胞および破片の懸濁液を取ります。

スト

レーナーを通過させ、破片を取り除きます。

濾液を遠心分離し、上清を除去します。

細胞を血清含有培地に再懸濁し、接着タンパク質でコーティングされた培養プレートに播種します。

細胞接着のためにインキュベートします。培地をシュワン細胞培地に置き換えます。シュワン細胞単層形成のためのインキュベート

培地を取り出し、バッファーで洗浄します。トリプシンとインキュベートして細胞を剥離します。

酵素活性を止めるために血清を含む培地を追加します。

細胞を集めて遠心分離します。上清を捨てます。

細胞をバッファーに再存在させ、抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズを加えます。

線

維芽細胞糖タンパク質に対する抗体に結合するためにインキュベートします。

遠心分離して上清を廃棄します。細胞をバッファーに再懸濁し、磁気分離器の磁場に配置された強磁性球を含む磁気分離カラムにロードします。

磁場はマイクロビーズに結合した線維芽細胞を保持し、シュワン細胞をフロースルーに集めることができます。

消化した神経を50ミリリットルのチューブに移し、188gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、10%FCSおよび1ミリリットルあたり50マイクログラムのゲンタマイシンを含む10ミリリットルのDMEMにペレットを再懸濁します。

次に、100マイクロメートルの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。摂氏4度で188gで10分間遠心分離した後、FCSとゲンタマイシンを含むDMEM4ミリリットルでペレットを再懸濁します。2つのポリ-L-リジンおよびラミニンでコーティングされた60ミリメートルの組織培養皿のそれぞれに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートし、プレートをインキュベーター内で2日間そのままにして放置します。

シュワン細胞懸濁液を摂氏4度で188 gで10分間遠心分離し、細胞ペレットを1 x 10⁷細胞あたり90マイクロリットルの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。次に、1 x 10⁷細胞あたり10マイクロリットルのThy-1マイクロビーズを追加します。再懸濁した溶液を摂氏8度の暗所で15分間インキュベートします。

次に、2ミリリットルの磁気細胞分離バッファーを細胞懸濁液に加えます。摂氏4度で300gで10分間遠心分離した後、ペレットを500マイクロリットルの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。磁気細胞分離カラムをセルセパレーターに入れ、1ミリリットルの磁気細胞分離バッファーでカラムを湿らせます。次に、セルをそれに適用して流れを集めます。