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コールドホモジナイゼーションバッファーでマウスの脳から歯状回を採取します。
機械的に解離して、ニューロン、グリア、幹細胞を放出します。
緩衝液の中性界面活性剤は細胞を透過性化し、核やその他の細胞小器官を放出します。
ホモジネートをろ過して組織の破片を取り除きます。次に、遠心分離し、細胞小器官を除去し、均質化バッファーに再懸濁して、無傷の細胞を溶解します。
再度遠心分離し、放出された細胞小器官を含む上清を除去し、核を洗浄バッファーに再懸濁します。
ろ過して破片を取り除き、遠心分離し、上清を除去します。
すべての核を標識する蛍光DNA染色と、ニューロン核を標識するニューロン核抗原(NeuN)に結合する蛍光色素結合抗体を導入します。
蛍光活性化核選別を使用して、より高いDNA染色蛍光強度とより高い散乱特性を持つ凝集体を同定し、単一の核を分離します。
単一の核を分析し、NeuN陽性のニューロン核を分離し、グリアと幹細胞に属するNeuN陰性の核を分離します。
緩いA乳棒を10ストロークし、続いてタイトなB乳棒を15ストロークして組織を均質化します。ホモジネートを事前に冷却した15ミリリットルのチューブに移します。Dounceホモジナイザーを1ミリリットルの冷たいHBですすぎ、同じチューブで混ぜ合わせます。
15ミリリットルのチューブに3ミリリットルのHBを加え、氷上で5分間インキュベートします。この核懸濁液をチューブをそっと反転させて2回混合します。0.5ミリリットルのHBを使用して、50ミリリットルの試験管の上に置かれた70マイクロメートルのストレーナーキャップを事前に濡らします。次に、細胞ストレーナーを0.5ミリリットルのHBで洗浄する前に、核懸濁液を濾します。
次に、細胞ストレーナーを取り外し、スイングバケット遠心分離機で試験管を500gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨てます。P1000ピペットを使用して、ペレットを4ミリリットルのHBにそっと再懸濁します。
氷上で5分間インキュベートした後、懸濁液を500 gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを3ミリリットルの洗浄培地に再懸濁します。0.5ミリリットルの洗浄媒体を使用して、50ミリリットルの試験管の上に35マイクロメートルのストレーナーキャップを事前に濡らします。次に、P1000ピペットを使用して一度に0.5ミリリットルの懸濁液をピペッティングすることにより、核懸濁液を濾します。
ストレーナーキャップを0.5ミリリットルの洗浄媒体で洗浄した後、チューブを氷の上に置きます。濾液を新しい15ミリリットルのチューブに移し、500 gで摂氏5分間、摂氏4度の間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを3ミリリットルの洗浄培地に再懸濁します。
遠心分離を繰り返し、マウス抗Neu抗体およびAlexaFlour488結合抗体と1マイクログラム/ミリリットルDAPIを含む1ミリリットルの洗浄培地にペレットを再懸濁します。暗闇の中で氷上で反応を45分間インキュベートします。
蛍光活性化核ソーティング(FANS)の場合は、免疫染色した核懸濁液を5ミリリットルの試験管に移し、フローサイトメトリー手順が開始されるまで氷上に置きます。
チューブをFACS装置に入れる前に、サンプルを穏やかな強度で3秒間渦巻きます。
染色核懸濁液からデータを取得するには、DAPIの高さとDAPI領域にゲートを設定して、細胞破片と凝集した核を除外します。次に、対数側方散乱またはSSC領域と対数前方散乱またはFSC領域のゲートを設定して、残りのDAPI染色凝集体または細胞破片から単一核を分離します。
次に、抗NeuNAF488およびFSC領域のゲートを設定することにより、NeuNAF488陰性集団を単離します。
分析後、ゲーティング戦略を使用して、50マイクロリットルの洗浄培地で満たされた1.5ミリリットルの収集チューブで抗NeuNAF488陰性集団を選別します。