線虫生殖細胞のニューロンへの細胞運命リプログラミング

遺伝子組み換え細菌を線虫増殖培地に乗せます。

細菌は、線虫クロマチン調節因子遺伝子を持つプラスミドを持っています。

培

地には、クロマチン調節因子遺伝子をdsRNAに転写する細菌ゲノムからのトランスジェニックRNAポリメラーゼの発現を誘発する誘導剤が含まれています。

ニューロン運命誘導転写因子遺伝子を保有するトランスジェニック線虫幼虫を熱ショックプロモーター下に添加する

細菌が摂取されると、摂取されたdsRNAはクロマチン調節因子の発現をダウンレギュレートするsiRNAを生成し、細胞運命の再プログラミングを促進します。

親の生殖細胞を介して、siRNAは子孫に受け継がれます。

突出

した外陰部表現型によって示される子孫生殖細胞におけるクロマチン調節因子発現のダウンレギュレーションは、それらの再プログラミングを可能にします。

子孫に熱ショックを加え、熱ショックプロモーターを活性化し、ニューロンの分化を引き起こし、生殖細胞をニューロンに変換するニューロン運命誘導転写因子を発現します。

ニューロンはトランスジェニック蛍光レポータータンパク質を発現し、顕微鏡的な視覚化を促進します。

反復ごとに50本のL4ワームをNGM RNAiプレートに手動で移します。白金線を使用してください。L4ワームは、腹側の約半分にある白い斑点で認識できます。次に、ワームを摂氏15度の暗闇で約7日間孵化させます。IPTGは光に敏感です。

F1の子孫がL3およびL4段階に達したら、より大きくて太い親動物から分離します。この時点で、lin-53に対するRNAiが成功したことを示す突出した外陰部表現型についてF1をスクリーニングします。RNAi 活性は致死性を引き起こす可能性もあり、摂氏 15 度を超えると増加します。G1を活性化し、F1子孫の生殖細胞からニューロンへの変換を誘導するには、暗闇の中で摂氏37度でワームに30分間熱ショックを与えます。より効率的な熱ショックを可能にするため、通気孔のあるインキュベーターを使用してください。

ヒートショック後、プレートを暗闇の中で摂氏25度で一晩インキュベートします。動物がL3中期に達する前に、ヒートショックによるQ1の過剰発現を誘導しないようにすることが重要です。これにより、標的外組織におけるQ1タンパク質の発現につながる可能性があります。翌日、蛍光光源とGFPフィルターをセットアップして、動物の中体領域での導入遺伝子由来の蛍光を調べます。