マウス網膜から得られたMüllerグリア細胞培養の確立

ミュラーグリアルまたはMG細胞、およびニューロンを含むマウス網膜を取ります。

それらを消化酵素を含む解離溶液に入れ、酵素が均一に分布するように穏やかに揺らしながらインキュベートします。

これらの酵素は細胞外マトリックスを分解し、個々の細胞を剥離します。

網膜を数回上下にピペットで動かして細胞を放出します。

酵素活性を停止するために阻害剤を追加してから、遠心分離します。

上清を捨てます。

MG細胞に特異的な成長因子を含む培地に細胞を再懸濁します。

細胞をウェルに移し、インキュベートします。

時間が経つにつれて、培地中の成長因子はMG細胞の成長と増殖を促進しますが、分裂していないニューロン細胞は死滅します。

メディアを取り出します。塩緩衝液で洗浄します。

消化酵素と一緒にインキュベートして、ウェルから細胞を切り離します。

細胞をチューブに集めてから遠心分離します。

死んだ神経細胞を含む上清を廃棄します。

さらなる分析のためにMG細胞を培地に再懸濁します。

原稿に記載されているように、パパインDNase I解離混合物を調製します。次に、先端を拡大したトランスファーピペットを使用して、網膜を持ち上げます。網膜が先端の底に落ち着くまで待ってから、過剰なHBSSなしで網膜をパパインDNase I混合物を含むチューブに放出します。

次に、チューブをインキュベーター内の章動器に置き、摂氏37度、二酸化炭素5%で10分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのピペットで慎重に上下にピペッティングして細胞を解離します。細胞が解離した後、パパイン解離キットから275マイクロリットルのオボムコイドプロテアーゼ阻害剤を加えてパパインを中和し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。

チューブを遠心分離機に入れ、相対遠心力300で摂氏4度で8分間回転させます。摂氏37度に予熱した成長培地の計算量に上皮成長因子を加えます。チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。

チューブの底にあるペレットに触れずに、上清を慎重に完全に取り除きます。次に、細胞ペレットを500マイクロリットルの上皮成長因子を添加した成長培地で再懸濁します。次に、細胞懸濁液を標識された12ウェルプレートの1つのウェルに移します。さらに500マイクロリットルの上皮成長因子を添加した成長培地でチューブをすすぎ、ウェルに加えます。

ウェルプレートを慎重に揺らします。次に、プレートを二酸化炭素と一緒に摂氏37度のインキュベーターに入れます。まず、90%から100%のセルコンフルエントを確認します。次に、培地を取り除き、1ミリリットルの冷たいHBSSを加えてウェルを洗浄します。プレートを軽く揺らし、痕跡を残さずにHBSSを取り除きます。

その後、予熱したトリプシン含有溶液を500マイクロリットル加えて、細胞をウェルから切り離します。穏やかに揺らし、摂氏37度のインキュベーターで2分間インキュベートします。プレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動した後、トリプシン含有溶液を傾けながら吸引します。細胞が完全に剥がれるまで、ウェルの上に慎重にゆっくりと数回分散させます。

次に、この細胞懸濁液を滅菌1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを遠心分離機に入れます。摂氏4度で8分間300回gで回転させ、チューブをバイオセーフティキャビネットに戻します。ペレットに触れずに上清を取り除きます。次に、600マイクロリットルの予熱した増殖培地を加え、約30〜40回上下にピペッティングすることにより、細胞ペレットを慎重に再懸濁します。