蛍光活性化核ソーティングを用いた脳組織からの細胞集団の単離

新鮮な凍結ヒト脳組織の一部を、コールドライシスバッファーを含む適切なグラインダーに移します。

乳棒を上下に動かして組織を機械的に破壊し、細胞を解放します。

溶解バッファー中の界面活性剤分子が細胞膜を破壊し、核を放出します。

内容物を適切な遠心分離管に移し、チューブの底に冷たいスクロース緩衝液を加えて密度勾配を作成します。

高速で遠心分離して、チューブの底にある核を分離します。

上清を廃棄し、核を緩衝生理食塩水に再懸濁します。

標的特異的蛍光色素結合抗体を核に添加し、インキュベートして抗体が標的核タンパク質に結合できるようにします。

核染色色素を添加して、無傷のDNAを視覚化します。

蛍光活性化核選別を実行して、異なる蛍光シグナルに基づいて異なる細胞集団の核を選別します。

新鮮な凍結ヒト成人皮質組織サンプルから約200〜400ミリグラムの組織の解剖を開始します。4ミリリットルの氷冷溶解バッファーを含む7ミリリットルのガラスティッシュダウンサーに組織を氷上に置き、組織を約50回粉砕します。

ホモジネートを12ミリリットルの超遠心ポリプロピレンチューブに移します。5ミリリットルのピペットを使用して、スクロースと組織ホモジネートの間の界面を乱すことなく、6.5ミリリットルの氷冷スクロース緩衝液を超遠心チューブの底に加えます。

核を採取するには、ライセートを101,814倍gで1時間超遠心分離し、ペレットを乱さずに上清と破片を注意深く吸引します。PBSを超遠心チューブに加え、核ペレットを再懸濁します。

単離された核の蛍光活性化選別を行うには、再懸濁したサンプルを約20マイクロリットルを、AlexaFlour555結合マウス抗NeuN抗体を含む抗体溶液に加えます。再懸濁したサンプルを約20マイクロリットルを、APC結合マウス抗PAX6抗体を含む抗体溶液に加えます。1時間のインキュベーション後、光から保護した加振しながら摂氏4度で、すべてのサンプルとコントロールに1対1,000の比率でDAPIを加えます。