0 閲覧数 • 5:00 分 • July 8th, 2025
灌流されたラット海馬の断片を取ります。
パパインとインキュベートして組織の細胞外マトリックスを消化し、ニューロン、星状細胞、ミクログリアなどの細胞を緩めます。
DNaseを加えて混ぜます。
直径を徐々に小さくするピペットを使用して組織を機械的に解離し、単一細胞懸濁液を得る。DNaseが汚染DNAを分解するためにインキュベートします。
懸濁液をストレーナーに通し、破片を取り除きます。
酵素活性を停止するために、二価イオンを含むバッファーを追加します。
酵素が豊富な上清を遠心分離して除去します。
次に、バッファーと抗ミエリン磁気ビーズを追加します。ビーズがミエリン破片に結合するようにインキュベートします。
インキュベーション後、遠心分離して上清を除去します。
混合物をバッファーに再懸濁し、磁気選別機の磁場に配置された強磁性球を含む磁気分離カラムにロードします。
磁場は、ミエリンのない細胞が通過している間、磁気ビーズに結合したミエリン破片をカラム内に保持します。
カラムをバッファーで洗浄し、ニューロン、星状細胞、およびミクログリアを含むフロースルーを収集します。
滅菌カミソリの刃を使用して、成人の脳組織から採取した各サンプルを6ウェル培養プレートの蓋で30〜400ミリグラムの小さな断片にさいの目に切ることから、神経解離を開始します。次に、組織を1ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSに浸漬し、ピペットを使用してサンプルを滅菌2ミリリットルの遠心分離管に移します。
すべての組織が収集されたら、サンプルを遠心分離し、上清を吸引し、サンプルを摂氏37度のウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを数回反転させて、沈降した組織片を再懸濁します。
インキュベーションの最後に、30マイクロリットルの新たに調製した酵素混合チューブを各サンプルに加え、チューブをそっと反転させます。次に、1とラベル付けされたパスツールピペットを使用して、気泡の発生に注意しながら、各サンプルを30回の上下粉砕で解離します。サンプルを摂氏37度でさらに15分間インキュベートし、5分ごとに反転させ、続いて先ほど示したように、パスツールピペット番号2でサンプルを解離させます。
次に、ピペット番号3に切り替えます。解離を繰り返し、サンプルをウォーターバスでさらに10分間インキュベートし、5分ごとに反転させます。インキュベーションの最後に、単一細胞懸濁液を80ミクロンの細胞ストレーナーを通して15ミリリットルのファルコンチューブにろ過し、各ストレーナーを10ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムフリーHBSSで洗浄して酵素反応を停止します。最後のサンプルがろ過されたら、チューブを回転させ、上清を吸引します。
細胞懸濁液からミエリンを枯渇させるには、ペレットを400マイクロリットルのミエリン除去バッファーに完全に再懸濁し、各チューブに適量のミエリン除去ビーズを加えます。細胞とビーズが完全に混合されるまで、溶液を上下にピペットで移動します。次に、サンプルを摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、各サンプルを5ミリリットルのミエリン除去バッファーで洗浄します。
セルが回転している間に、各サンプルに1つのカラムを磁気選別機の磁場に置き、各カラムの上にきれいな80ミクロンのフィルターを置きます。各フィルターとカラムを1ミリリットルのミエリン除去バッファーで3回すすぎ、すべてのフロースルーを廃棄物容器に集めます。
最後のすすぎ後、5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブを各カラムの真下に置き、溶出液を回収します。次に、サンプルから上清を吸引し、ペレットを500マイクロリットルのミエリン除去バッファーに再懸濁します。
すぐに細胞懸濁液をカラムに塗布し、下のチューブに細胞を集めます。次に、各フィルターとカラムを洗浄ごとに1ミリリットルのミエリン除去バッファーで4回すすぎます。最後の洗浄後、細胞を回転させ、上清を吸引します。