蛍光活性化細胞選別による線虫からのニューロンの単離

トランスジェニックCaenorhabditis elegansワームから得られた細胞の懸濁液を培地中で取ります。

懸

濁液には、神経系のニューロンを含むさまざまな組織からの細胞が含まれています。

トランスジェニックワームは、小胞膜貫通トランスポーターに結合した蛍光タンパク質を発現するように操作されました。このトランスポーターは、神経伝達物質アセチルコリンを運ぶシナプス小胞に存在し、体全体のコリン作動性ニューロンに見られます。

細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄します。蛍光活性化細胞選別(FACS)のために、細胞を新鮮な培地に再懸濁します。

FACSを使用して細胞懸濁液を分析します。蛍光標識コリン作動性ニューロンは、適切な波長の光にさらされると蛍光を発し、他の標識されていない細胞から分離します。

単離したニューロンをマルチウェルプレートに移します。水分レベルを維持するために、加湿チャンバーで細胞をインキュベートします。

単離された細胞懸濁液から細胞を10,000倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。フローサイトメーターの過負荷を避けるために、上清を廃棄し、ペレット化された細胞をL-15を添加した培地に再懸濁し、1ミリリットルあたり600万細胞以下の細胞密度にします。次に、サンプルを選別できるフローサイトメーターを使用して、GFP陽性発現によって細胞を選別します。

GFP陰性細胞は、非細胞型特異的分析のコントロールとして使用できます。この後、単離された細胞を滅菌6ウェルプレートのウェルにプレーニングします。プレートをプラスチック容器に入れます。湿らせたワイプまたはソフトティッシュペーパーを加えて細胞に水分を加え、摂氏20度でインキュベートします。