マウス脊髄からの初代混合グリア細胞培養の確立

マウスの脊髄を採取し、断片に切ります。

断片をタンパク質分解酵素とDNaseを含むチューブに移します。ボルテックスしてインキュベートします。

酵素は組織の細胞外マトリックスを消化し、DNaseは汚染された遊離DNAを分解します。

再びボルテックスし、ピペットを繰り返して組織解離を完了し、単一細胞懸濁液を得る。

遠

心分離して上清を除去します。DNase、プロテアーゼ阻害剤、ボルテックスを含む溶液に細胞を再懸濁します。阻害剤は酵素を中和します。

新しい阻害剤溶液を上に重ね、遠心分離し、上清を取り除きます。

細胞を密度勾配培地に再懸濁し、ボルテックスし、遠心分離します。

細胞は下部に沈殿し、ミエリン破片は上部に残ります。

破片を捨てます。バッファーで繰り返し洗浄し、遠心分離し、上清を除去します。細胞を増殖培地に再懸濁します。

細胞をプレートします。コーティングされていない表面は、グリア細胞の付着を容易にします。

使用済み培地を取り除き、新しい培地を加えてグリア細胞の増殖を誘導し、混合グリア培養を確立します。

組織培養フードで作業し、4匹のマウス脊髄をHBSSのペトリ皿に移します。滅菌ハサミと鉗子を使用して、各脊髄を細かく切ります。次に、パパインDNase酵素混合物が入った50ミリリットルの円錐形チューブに移します。酵素混合物にHBSSを移すと、酵素の性能が低下する可能性があるため、避けてください。

単一細胞懸濁液を得るには、組織片が十分に消化されることが重要です。ただし、過剰に消化すると、生存細胞が減少します。各ラボはパイロットテストを実施して、細胞に最適なものに基づいて正確な消化時間を決定する必要があります。

次に、チューブを穏やかにボルテックスし、毎分150回転で軌道振とうしながら摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをボルテックスし、5ミリリットルのピペットを使用して組織を激しく粉砕し、さらなる解離を促進します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、室温で300回gで5分間遠心分離します。

遠心分離中に、300マイクロリットルの再構成アルブミンオボムコイド阻害剤溶液を滅菌チューブ内の2.7ミリリットルのEBSSに加え、よく混合します。次に、150マイクロリットルのDNase溶液を加えます。遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを新たに調製したアルブミンオボムコイド阻害剤およびDNase溶液に再懸濁します。細胞ペレットを破壊するためによく渦を巻き起こします。

次に、DNaseを含まない再構成アルブミンオボムコイド阻害剤溶液3ミリリットルを細胞懸濁液に加えます。細胞を室温で70回gで6分間遠心分離します。スピン後、膜断片を含む上清を取り除き、ペレットを保持します。

解離した脊髄細胞からミエリンを除去するには、まず、細