不死化多能性耳前駆細胞の螺旋神経節ニューロンへの分化と分化の評価

細胞培養基質でコーティングされた滅菌カバーガラスを含むマルチウェルプレートを取ります。

不死化多能性耳前駆細胞(iMOP)をニューロン分化培地に導入します。

iMOP は、聴覚情報を脳に伝達するらせん神経節ニューロン (SGN) を含むさまざまな内耳細胞の前駆体です。

キュベートして、細胞が基質に付着できるようにします。培地は、iMOPのSGNへの分化を誘導します。

タンパク質架橋を誘導し、細胞形態を維持するための固定剤と、細胞膜を透過処理する界面活性剤溶液を追加します。

非特異的標識を防ぐためにブロッキング試薬を導入します。

ニューロン分化マーカーに特異的な蛍光色素結合抗体を添加してインキュベートし、抗体がSGNを標識できるようにします。

結合していない抗体を除去し、蛍光核染色を含む封入剤でカバーガラスをマウントします。

蛍光顕微鏡を使用して、抗体シグナルを検出し、iMOPのSGNへの分化を確認します。

まず、丸いガラスカバーガラスを滅菌済みの100ミリプレートに入れ、70%エタノールに浸して洗浄します。カバーガラスを軽くかき混ぜて覆われていることを確認し、皿を室温で 10 分間放置します。次に、カバーガラスを滅菌1x PBSで3回すすぎ、次に滅菌水で1回すすぎます。

次に、カバーガラスを組織培養フードでUV光に15分間さらして乾燥させます。すぐに使用するには、24ウェルプレートの各ウェルに滅菌カバーガラスを1つ入れ、プレートを軽く振って、すべてのカバーガラスが平らになるようにします。次に、ポリ-D-リジン1ミリリットルあたり10マイクログラムを含む0.25ミリリットルの1x PBSを各ウェルに加えて、カバーガラスをコーティングします。

プレートを摂氏37度で1時間インキュベートした後、ポリ-D-リジン溶液を取り出し、ウェルを滅菌1x PBSで3回洗浄します。最後の洗浄からの液体が吸引されたら、1ミリリットルあたり10マイクログラムのラミニンを含む0.25ミリリットルの1x PBSを24ウェルのそれぞれに導入します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートした後、ラミニン溶液を吸引します。次に、各ウェルを1ミリリットルの1x PBSで3回洗浄しますが、細胞をプレーティングする準備が整うまで、最後の洗浄のPBSをウェルに残します。

ニューロンの分化を開始するには、前述のように解離した耳球からの細胞をカウントし、予熱したニューロン分化培地に再懸濁します。1〜1.5 x 10⁵ iMOP細胞を、コーティングされたカバーガラスを含むプレートの各ウェルに播種することによって進めます。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素とともにインキュベートし、ニューロン分化培地を1日おきに交換します。

7日後、培地を吸引し、各ウェルに4%ホルムアルデヒドを加え、室温で15分間放置することにより、カバーガラスに取り付ける必要がある細胞を固定します。次に、ホルムアルデヒドを除去し、0.1%Triton X-100を含む1x PBSで細胞を1回洗浄します。次に、洗浄バッファーを取り除き、10%の正常なヤギ血清と0.1%のTriton X-100を含む1x PBSからなるブロッキングバッファーを各ウェルに加えます。

細胞を室温で1時間放置した後、液体を取り出し、Cdkn1bまたはTubb3抗体の適切な希釈液を含むブロッキングバッファーと交換します。摂氏4度で一晩インキュベートした後、1%Triton X-100を含む1x PBSで細胞を1回洗浄し、次に前述のように免疫染色を続行します。染色が完了したら、ウェルに1x PBSを加えて最終洗浄を行います。

分析用に準備するには、染色細胞が付着しているカバーガラスを24ウェルプレートから取り外し、スライドガラス上の封入剤の上に置きます。封入剤を摂氏4度で一晩乾燥させた後、前述のように落射蛍光画像を取得します。