JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 4:29 分 • July 8th, 2025
トランスジェニック妊娠マウスを採取し、胚を含む子宮を外科的に分離し、洗浄して残留血液を取り除きます。
蛍光標識運動ニューロンを含む胚を取り出し、マルチウェルプレートの蓋に移します。
溶融アガロースを加え、蓋を冷やしてゲル形成を誘導し、胚を埋め込みます。
蛍光顕微鏡下で、動眼神経核と眼を一直線に整列させ、アガロースをその線と平行にトリミングします。
胚を標本ステージに固定し、コールドスライスバッファーで満たされたビブラトームチャンバーに入れます。
ビブラトームを使用して、動眼神経核と目を含むスライスを生成します。核は眼球運動を制御する動眼神経を形成します。
スライスを培地を含むマルチウェルプレート内の培養インサートに移し、インキュベートします。
蛍光顕微鏡を使用して、一定の間隔で画像化し、軸索を伸ばして目に到達する蛍光標識眼球運動ニューロンを観察します。
手順を開始する前に、まず、時間指定の交配から胚10.5日目に超音波で妊娠を確認します。胚を採取し、妊娠中のマウスの腹部に70%エタノールをスプレーし、ハサミを使用して腹腔を開き、子宮を抽出します。新鮮な氷冷HBSSの2番目のペトリ皿に臓器を入れる前に、氷冷したHBSSのペトリ皿で子宮を洗浄します。
解剖顕微鏡下で、子宮角から胚を取り出し、それらの個々の羊膜嚢を取り出し、各胚を氷上の12ウェルプレートの蓋の下側に置き、採取します。濾紙を使用して、胚自体に触れずに各胚の周囲の液体を取り除き、胚を液体4%低融点アガロースに浸します。
プレートの蓋を氷の上に置き、アガロースを固めます。アガロースが固まったら、胚を裏返し、各サンプルの反対側を追加のアガロースで覆います。アガロースの2番目のボリュームが固まったら、蛍光解剖顕微鏡を使用して各胚の周りのアガロースをトリミングし、各胚がビブラトームステージで適切に配向されるようにします。
動眼神経核と初期の軸索成長は蛍光でなければなりません。核、外出軸索、および目が線を形成するように各胚を整列させ、カミソリの刃を使用してアガロースをこの線と平行にトリミングします。次に、ビブラトームチャンバーに氷冷のスライスバッファーを入れ、ブレードが動眼球核と目と平行になるように、最初の胚をビブラトーム段階に瞬間接着します。
瞬間接着剤が乾いたら、胚がブレードの反対側を向くようにビブラトームステージを沈め、新しいビブラトーンブレードを使用して400〜450マイクロメートルのスライスを取得します。滅菌トランスファーピペットを使用して、各スライスを採取時にコールドスライスバッファーに移し、蛍光解剖顕微鏡を使用して、動眼神経核と眼を含むスライスを選択します。
滅菌トランスファーピペットを使用して、スライスを細胞培養に移し、ウェルあたり1.5ミリリットルの培地を含む6ウェルプレートに挿入し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。下段から残留アガロースを取り除き、次の胚をステージに瞬間接着剤で貼り付け、すべての胚が切片化およびプレーティングされるまでスライスを収集し続け、位相差および蛍光顕微鏡で30分ごとにスライスを最大72時間画像
化します。