0 閲覧数 • 3:15 分 • July 8th, 2025
細胞生存を促進するRhoキナーゼ阻害剤を含む培地中に、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)を含むマルチウェルプレートから始めます。
培地を栄養素と成長因子を含む必須培地と交換します。
iPS細胞の増殖と前駆細胞への分化を可能にするためにインキュベートします。
この培地を線維芽細胞増殖因子とレチノイン酸を添加した分化培地と交換し、インキュベートします。
成長因子は前駆細胞から微小血管内皮細胞への分化を促進し、レチノイン酸はタイトジャンクションタンパク質の合成を促進します。
細胞を洗浄し、酵素EDTA溶液で処理して細胞を剥離し、単一細胞懸濁液を作成します。
遠心分離して細胞を収集し、上清を除去します。次に、細胞を新鮮な分化培地に再懸濁します。
この細胞懸濁液を、コラーゲンと接着タンパク質でコーティングされたマルチウェルプレートに播種します。
インキュベートして細胞接着を可能にし、脳微小血管内皮細胞に似た細胞間にタイトジャンクションを形成します。
ヒトiPS細胞からのBMEC分化を誘導するには、コンフルエントiPS細胞培養物をDPBSで1回洗浄してから、細胞を適切な量の酵素EDTAとともに摂氏37度で約5分間インキュベートします。
単一細胞懸濁液が得られたら、遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを適切な量の幹細胞培地に再懸濁し、計数のために10マイクロモルのROCK阻害剤を添加します。
細胞を1立方センチメートル濃度あたり1.56倍の10〜4番目の細胞に希釈し、2ミリリットルの細胞を6ウェルの平底の個々のウェルに播種します。細胞培養インキュベーターで24時間後、各ウェルの上清をE6培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻してさらに4日間します。
iPS細胞由来のBMECを精製するには、ウェルごとに適切な量の新しく調製したコラーゲンIVおよびフィブロネクチン溶液で継代培養プレートをコーティングし、プレートを摂氏37度で最低2時間インキュベートします。
分化の6日目に、遠心分離によって細胞を収集し、B27、塩基性線維芽細胞増殖因子、およびレチノイン酸を添加した新鮮なヒト内皮血清フリー培地の適切な量にペレットを再懸濁します。細胞をコラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングされた24ウェル平底プレートの各ウェルにプレーティングします。