iPS細胞由来前駆細胞を用いた血液脳関門チップの作製

多孔質膜で分離されたマトリックスコーティングされたチャネルが重ねられたマイクロ流体チップを取ります。

iPS細胞由来の神経前駆細胞を上部チャネルに播種します。細胞の接着のためにインキュベートし、洗浄して付着していない細胞を除去します。

次に、iPS細胞由来の脳微小血管内皮細胞を下部チャネルに播種します。

チップを反転させてインキュベートし、内皮細胞を下部チャネルの膜側に付着させます。

次に、チップを反転させて細胞をチャネルの下側に付着させ、単層チューブ状の構造を形成します。両方のチャネルを細胞特異的培地で洗浄します。

上部チャネルに神経分化培地を、下部チャネルに内皮細胞培地を連続的に流します。

内皮細胞は培地の成長因子を利用して成熟し、血管に似たタイトジャンクションを形成して血液側を形成します。

神経栄養因子は、神経前駆細胞をさまざまな脳細胞に分化させ、脳側を形成します。これらの細胞は内皮細胞と相互作用し、チップ上に血液脳関門を形成します。

まず、準備したチップスが入った皿をバイオセーフティキャビネットに持っていきます。P200ピペットを使用して、200マイクロリットルの神経分化培地を入口に加え、出口から液体を引き抜いて、両方のチャネルを優しく洗浄します。ポートとの接触を避け、チップの表面から余分な媒体液滴を慎重に吸引します。

細胞懸濁液を穏やかに撹拌して、均一な細胞懸濁液を確保します。iPS細胞由来の神経前駆細胞を上部チャネルに播種して脳側を生成するには、1ミリリットルあたり1 x 10⁶細胞の濃度で30〜100マイクロリットルの細胞懸濁液を含むP200チップを上部チャネル入口に追加し、チップをピペットからそっと放します。

空の P200 ピペットを使用してプランジャーを押し、上部チャネルの出口に挿入し、シングルセル懸濁液をチップから慎重に引っ張ります。チップを顕微鏡に移して、上部チャネル内の細胞の均一な分布における播種密度を確認します。20%の被覆率で細胞密度を確認した後、すぐにチップをインキュベーターに摂氏37度で2時間入れます。

その後、新鮮な神経分化培地を入口に加え、出口からピペットで液体をプールすることにより、付着していない細胞を洗い流します。細胞を摂氏37度の静的条件下に保ち、毎日神経分化培地を交換します。iNPCが取り付けられた後、または播種の翌日に、準備したチップが入った皿をバイオセーフティキャビネットに持っていきます。200マイクロリットルの内皮細胞培地で下部チャネルを優しく洗浄します。

ポートとの接触を避けて、チップの表面から過剰な内皮細胞培地の液滴を慎重に吸引し、両方のチャネルに培地を残すようにします。細胞懸濁液を穏やかに撹拌して、均一な細胞懸濁液を確保します。P200ピペットを使用して、1ミリリットルあたり14〜20 x 10⁶細胞