ラット脊柱からの初代背根神経節細胞培養の確立

ラットの脊柱を取ります。側面に沿って2つの切り込みと1つの横方向の切り込みを行います。

と椎骨の背側部分を取り除きます。

脊髄を抜歯します。

腰椎に沿って両側に位置する後根神経節(DRG)を特定します。

DRGには、グリア細胞に囲まれたニューロンが含まれています。

DRGを切除し、皿に集めます。無血清培地で組織を繰り返し洗浄します。

DRGをコラゲナーゼ溶液を含むプレートに移し、インキュベートします。コラゲナーゼは細胞外マトリックスを分解します。

バッファーで洗浄します。トリプシン-EDTAを加えてインキュベートして細胞間結合を破壊し、細胞を緩めます。

DRGをチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄します。

組織を培地に再懸濁し、ピペットを繰り返して細胞を放出します。

細胞をポリマーでコーティングされた培養プレートウェルに移して、付着を容易にします。

培地を取り除き、阻害剤と成長因子を含む新しい培地を追加します。

阻害剤はグリア細胞の増殖を制限し、成長因子はニューロンの成長を促進します。

後2〜3週間のラットの体幹から腰椎後根神経節を採取します。まず、脊柱の側面に沿って 2 つの切り込みを入れ、腰椎の吻側範囲をマークするために横方向の切り込みを 1 つ行います。次に、骨切断鉗子を使用して脊椎の背筋を取り除きます。次に、椎骨の背側部分を切除して脊髄を露出させ、解剖はさみと鉗子を使用して脊髄を除去します。

最後の肋骨から椎骨を数えて腰椎 DRG を特定します。この図は椎骨の位置を示しています。マイクロハサミを使用して、L1 から L6 までの 12 個の両側腰椎 DRG を収集します。付着した神経線維をすべて除去して、培養物の純度を向上させます。各腰椎DRGを、2ミリリットルの氷冷無血清培地を含む35ミリメートルの培養皿に移します。

DRGを含む35ミリメートルのディッシュを層流フードに移し、DRGを無血清培地でピペットで3回洗浄します。滅菌ピンセットを使用して、DRGを2ミリリットルの滅菌コラゲナーゼ1A型を含む新しい35ミリメートル培養皿に移動します。組織を摂氏37度の組織培養インキュベーターのコラゲナーゼ溶液に30分間入れて、細胞の解離を開始します。

インキュベーション後、コラゲナーゼ溶液を取り除き、DRGを2ミリリットルのハンクバランス塩溶液で3回洗浄します。次に、2ミリリットルの予熱した0.05%トリプシン-EDTAを皿に加え、以前と同様にインキュベーターでDRGを30分間消化します。消化後、ガラスピペットを使用して、2ミリリットルのDRG含有溶液を15ミリリットルの遠心分離管に移します。

DRGがガラスピペットに付着する可能性があるため、この手順は注意して実行する必要があります。DRG損失は、DRG含有溶液をガラスピペットの先細りの端に保持し、溶液をゆっくりと、しかし一時停止することなく遠心分離管に移すことで回避できます。

次に、溶液を摂氏4度で5分間、290倍gで遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、さらに2ミリリットルの無血清培地を加えてDRGを再懸濁します。2ミリリットルの予熱培地を使用して洗浄を2回繰り返し、最終遠心分離後に組織を再懸濁します。

事前に準備した滅菌火炎研磨ピペットを使用して、DRGを手動で約60回粉砕します。次に、ウェルあたり1ミリリットルの培地を含むポリ-L-リジンでコーティングされた24ウェルプレートをCO2インキュベーターから取り出します。インキュベートした培地を皿から吸引します。

1匹のラットのDRG細胞を4つのウェルに播種します。これにより、ウェルあたり約500,000細胞の播種密度が得られます。翌日、培地を10マイクロモルのAraCと100ナノグラム/ミリリットルNGFを添加した培地と交換します。