ラット脊柱からの初代背根神経節細胞培養の確立

ラットの脊柱を取ります。側面に沿って2つの切り込みと1つの横方向の切り込みを行います。

背筋

と椎骨の背側部分を取り除きます。

脊髄を抜歯します。

腰椎に沿って両側に位置する後根神経節(DRG)を特定します。

DRGには、グリア細胞に囲まれたニューロンが含まれています。

DRGを切除し、皿に集めます。無血清培地で組織を繰り返し洗浄します。

DRGをコラゲナーゼ溶液を含むプレートに移し、インキュベートします。コラゲナーゼは細胞外マトリックスを分解します。

バッファーで洗浄します。トリプシン-EDTAを加えてインキュベートして細胞間結合を破壊し、細胞を緩めます。

DRGをチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄します。

組織を培地に再懸濁し、ピペットを繰り返して細胞を放出します。

細胞をポリマーでコーティングされた培養プレートウェルに移して、付着を容易にします。

培地を取り除き、阻害剤と成長因子を含む新しい培地を追加します。

阻害剤はグリア細胞の増殖を制限し、成長因子はニューロンの成長を促進します。

生

後2〜3週間のラットの体幹から腰椎後根神経節を採取します。まず、脊柱の側面に沿って 2 つの切り込みを入れ、腰椎の吻側範囲をマークするために横方向の切り込みを 1 つ行います。次に、骨切断鉗子を使用して脊椎の背筋を取り除きます。次に、椎骨の背側部分を切除して脊髄を露出させ、解剖はさみと鉗子を使用して脊髄を除去します。

最後の肋骨から椎骨を数えて腰椎 DRG を特定します。この図は椎骨の位置を示しています。マイクロハサミを使用して、L1 から L6 までの 12 個の両側腰椎 DRG を収集します。付着した神経線維をすべて除去して、培養物の純度を向上させます。各腰椎DRGを、2ミリリットルの氷冷無血清培地を含む35ミリメートルの培養皿に移します。

DRGを含む35ミリメートルのディッシュを層流フードに移し、DRGを無血清培地でピペットで3回洗浄します。滅菌ピンセットを使用して、DRGを2ミリリットルの滅菌コラゲナーゼ1A型を含む新しい35ミリメートル培養皿に移動します。組織を摂氏37度の組織培養インキュベーターのコラゲナーゼ溶液に30分間入れて、細胞の解離を開始します。

インキュベーション後、コラゲナーゼ溶液を取り除き、DRGを2ミリリットルのハンクバランス塩溶液で3回洗浄します。次に、2ミリリットルの予熱した0.05%トリプシン-EDTAを皿に加え、以前と同様にインキュベーターでDRGを30分間消化します。消化後、ガラスピペットを使用して、2ミリリットルのDRG含有溶液を15ミリリットルの遠心分離管に移します。

DRGがガラスピペットに付着する可能性があるため、この手順は注意して実行する必要があります。DRG損失は、DRG含有溶液をガラスピペットの先細りの端に保持し、