マウス中脳初代ニューロンへの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスへの感染

カバーガラス上の胚マウス中脳細胞培養から始めます。

ニューロン特異的プロモーターの下で蛍光カルシウム指示薬複合体をコードする操作されたアデノ随伴ウイルスで処理します。

ウイルスの付着と内在化のためにインキュベートします。

培地を取り出して結合していないウイルスを除去し、培地を加えてインキュベートします。

内在化されたウイルスは核内でゲノムを放出し、そこでニューロン特異的プロモーターが初代ニューロンでのみカルシウム指示複合体の産生を促進します。

これらの複合体には、カルシウム結合タンパク質とM13ペプチドでタグ付けされた蛍光タンパク質が含まれます。

カバーガラスをカルシウムイオンが豊富な記録バッファーの入った皿に移し、ライブ共焦点イメージング用の記録チャンバーに入れます。

グルタミン酸記録バッファーを導入すると、グルタミン酸がイオンチャネルと結合し、カルシウムイオンが侵入します。

これらのイオンは複合体に結合し、コンフォメーション変化と蛍光発出を引き起こします。

ライブイメージングでは、明るいニューロンはウイルス感染を示しています。

まず

、ディッシュあたり1マイクロリットルのhSyn-GCaMP6f AAVを含む1ミリリットルの無血清DMEM培地を調製します。各皿から細胞培養培地を吸引し、調製したDMEMをhSyn-GCaMP6fで1ミリリットルに置き換えます。皿を摂氏37度のインキュベーターに1時間戻します。

インキュベーション後、培地をAAVで吸引し、3ミリリットルの細胞培養培地と交換します。皿を摂氏37度で5〜7日間インキュベートし、このウイルス感染期間中、2〜3日ごとに培地を交換します。

原稿の指示に従って、1リットルのHEPES記録バッファー、200ミリリットルの20マイクロモルグルタミン酸記録バッファー、および200ミリリットルの10マイクロモルNBQX記録バッファーを準備します。

滅菌35ミリメートルのペトリ皿に3ミリリットルの記録バッファーを入れます。インキュベーターから感染した培養物を含むペトリ皿を取り出します。次に、先端の細い鉗子で1つのカバーガラスの端を慎重につかみ、記録バッファーで皿に移します。

残りのカバーガラスを培地に入れ、摂氏37度のインキュベーターに戻し、記録バッファーを含む皿を共焦点顕微鏡に移します。イメージングソフトウェアを起動します。初期化中に、蠕動ポンプを始動し、ラインを記録バッファーに入れます。次に、流量を毎分 2 ミリリットルに校正します。

感染したカバーガラスをペトリ皿から細い鉗子で記録槽に移します。10倍の水浸対物レンズと明視野光を使用して、焦点面を見つけ、ニューロン細胞体が高密度にある領域を探します。次に、40倍対物レンズに切り替えて、サンプルの焦点を再調整します。

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