マウス中脳初代ニューロンへの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスへの感染

カバーガラス上の胚マウス中脳細胞培養から始めます。

ニューロン特異的プロモーターの下で蛍光カルシウム指示薬複合体をコードする操作されたアデノ随伴ウイルスで処理します。

ウイルスの付着と内在化のためにインキュベートします。

培地を取り出して結合していないウイルスを除去し、培地を加えてインキュベートします。

内在化されたウイルスは核内でゲノムを放出し、そこでニューロン特異的プロモーターが初代ニューロンでのみカルシウム指示複合体の産生を促進します。

これらの複合体には、カルシウム結合タンパク質とM13ペプチドでタグ付けされた蛍光タンパク質が含まれます。

カバーガラスをカルシウムイオンが豊富な記録バッファーの入った皿に移し、ライブ共焦点イメージング用の記録チャンバーに入れます。

グルタミン酸記録バッファーを導入すると、グルタミン酸がイオンチャネルと結合し、カルシウムイオンが侵入します。

これらのイオンは複合体に結合し、コンフォメーション変化と蛍光発出を引き起こします。

ライブイメージングでは、明るいニューロンはウイルス感染を示しています。

、ディッシュあたり1マイクロリットルのhSyn-GCaMP6f AAVを含む1ミリリットルの無血清DMEM培地を調製します。各皿から細胞培養培地を吸引し、調製したDMEMをhSyn-GCaMP6fで1ミリリットルに置き換えます。皿を摂氏37度のインキュベーターに1時間戻します。

インキュベーション後、培地をAAVで吸引し、3ミリリットルの細胞培養培地と交換します。皿を摂氏37度で5〜7日間インキュベートし、このウイルス感染期間中、2〜3日ごとに培地を交換します。

原稿の指示に従って、1リットルのHEPES記録バッファー、200ミリリットルの20マイクロモルグルタミン酸記録バッファー、および200ミリリットルの10マイクロモルNBQX記録バッファーを準備します。

滅菌35ミリメートルのペトリ皿に3ミリリットルの記録バッファーを入れます。インキュベーターから感染した培養物を含むペトリ皿を取り出します。次に、先端の細い鉗子で1つのカバーガラスの端を慎重につかみ、記録バッファーで皿に移します。

残りのカバーガラスを培地に入れ、摂氏37度のインキュベーターに戻し、記録バッファーを含む皿を共焦点顕微鏡に移します。イメージングソフトウェアを起動します。初期化中に、蠕動ポンプを始動し、ラインを記録バッファーに入れます。次に、流量を毎分 2 ミリリットルに校正します。

感染したカバーガラスをペトリ皿から細い鉗子で記録槽に移します。10倍の水浸対物レンズと明視野光を使用して、焦点面を見つけ、ニューロン細胞体が高密度にある領域を探します。次に、40倍対物レンズに切り替えて、サンプルの焦点を再調整します。

色素リストウィンドウでAlexaFluor 488を選択して適用します。蛍光色素の露出オーバーや光退色を防ぐために、HVとレーザー出力を低く設定してください。

AlexaFluor 488チャンネルの場合、HVを500に、ゲインを1倍、オフセットを0に設定します。488 レーザー ラインの出力を 5% に設定します。ピンホールのサイズを300マイクロメートルに増やし、「フォーカスx2」スキャンオプションを使用して、発光信号を過飽和レベルに最適に調整します。その後、各チャンネルの最適な視認性が得られるように設定を調整できます。

顕微鏡の設定が最適化されたら、ステージを動かして、GCaMP6f蛍光の自発的な変化を示す複数の細胞がある領域を見つけ、イメージングに必要な平面に焦点を合わせます。

「クリップ矩形」ツールを使用して、イメージングフレームを1秒弱のフレーム間隔を実現できるサイズにクリップします。間隔ウィンドウを 1.0 の値に設定し、num ウィンドウを 600 に設定します。

T シリーズ ムービーをキャプチャするには、「時間」オプションを選択します。次に、「XYt」スキャン オプションを使用してイメージングを開始します。イメージングの進行状況バーを観察し、適切な時点でHEPES記録バッファーから20マイクロモルのグルタミン酸記録バッファーにラインを移動します。

イメージングが完了したら、「シリーズ完了」ボタンを選択し、完成したTシリーズムービーを保存します。培養ニューロンが合計10分間グルタミン酸にさらされるように、さらに5分間グルタミン酸を灌流し続けます。画像化するカバーガラスごとにこのプロセスを繰り返します。